obiecte

Acest articol a fost actualizat

abstract

Fundal:

MicroARN-urile (miARN-urile) sunt regulatori cheie ai expresiei genelor. În acest studiu, am investigat dacă expresia modificată a miARN joacă un rol important în definirea fenotipului cancerului mamar inflamator (IBC).

metode:

Am folosit tehnologia PCR cantitativă pentru a evalua expresia a 384 miARN în 20 de IBC și 50 de probe non-IBC. Pentru a obține o înțelegere a funcțiilor biologice dereglate de expresia aberantă a miARN, am căutat ținte directe miARN efectuând o analiză a coeficientului de corelație pereche la nivelul de expresie al 10.962 ARN mesager (ARNm) și comparând aceste rezultate cu țintele miARN preconizate de la TargetScan 1.

rezultatele:

Am identificat 13 miARN pentru care nivelurile de expresie au reușit să prezică în mod corect natura eșantionului analizat (IBC vs non-IBC). Pentru acești miARN, am găsit un total de 17.295 perechi miARN-ARNm corelate, dintre care 7012 și 10.283 perechi au prezentat corelații negative și pozitive. Pentru cele patru miARN (miR-29a, miR-30b, miR-342-3p și miR-520a-5p), genele corelate au fost în concordanță cu țintele dorite. Analiza îmbogățirii genelor pe aceste gene a arătat o îmbogățire semnificativă în procesele biologice legate de proliferarea celulară și transducția semnalului.

concluzie:

Din câte știm, acest studiu reprezintă prima analiză integrată a miARN-urilor și expresiei mARN-ului în IBC. Am identificat un set de 13 miARN-uri a căror expresie diferă între IBC-uri și non-IBC-uri, făcând ca acești miARN să fie markeri candidați pentru subtipul IBC.

Principalul

MicroARN-urile (miARN-urile) sunt o clasă de ARN-uri necodificatoare capabile să regleze expresia genelor la nivel post-transcripțional prin legarea la regiunea 3'-netradusă a unui ARN mediator țintă (ARNm) prin omologie de secvență parțială și provocând blocarea translațională. și/sau degradarea ARNm (He și Hannon, 2004). La momentul scrierii, au fost descrise 721 gene miARN umane (//microrna.sanger.ac.uk/sequences) și se estimează că fiecare dintre miARN vizează aproximativ 100 de molecule diferite de mARN (Brennecke și colab., 2005; Lewis și colab. al., 2005, Lim și colab., 2005). MiRNA joacă un rol important în procesele de bază, cum ar fi diferențierea, creșterea celulară, răspunsul la stres și moartea celulară (Miska, 2005; Zamore și Haley, 2005). Ca urmare, expresia modificată a miARN poate contribui la bolile umane, inclusiv la cancer. De fapt, spectrul miARN exprimat în cancerele solide este foarte diferit de celulele normale și țintele prezise pentru miARN exprimate diferențial sunt îmbogățite semnificativ pentru supresorii de proteine ​​și oncogene care codifică proteinele (Lu și colab., 2005; Volinia și colab., 2005). 2006).

Se concentrează pe cancerul mamar, nivelurile de miARN specifice variază între țesutul mamar malign și normal și sunt capabile să clasifice tumorile în funcție de variabilele clinicopatologice, cum ar fi indicele de proliferare, receptorii hormonilor steroizi și starea Her2/neu, starea nodală și stadiul tumorii ( Iorio și colab., 2005; Mattie și colab., 2006; Lowery și colab., 2008). În plus, miARN-urile sunt exprimate diferențial între subtipurile de cancer mamar molecular, inclusiv luminal A, luminal B, bazal și Her2 + (Blenkiron și colab., 2007). Acest lucru indică potențialul semnăturilor miARN ca noi indicatori de prognostic care pot contribui la îmbunătățirea selecției pacienților pentru terapia adjuvantă. Foekens și colab. (2008) au legat recent patru miARN (miR-7, miR-128a, miR-210 și miR-516-3p) cu un timp mai scurt de metastaze îndepărtate în receptorul de estrogen (ER), în ganglionii limfatici. cancer mamar negativ.

Materiale și metode

Probele pacienților

Probele tumorale au fost obținute de la banca de țesuturi a Spitalului General Sint-Augustinus (Anvers, Belgia). Datele clinice și patologice sunt stocate într-o bază de date în conformitate cu politica de confidențialitate a spitalului. Probele au fost transferate către patologi imediat după rezecție și o porțiune din țesut a fost plasată în azot lichid și apoi depozitată la -180 ° C. 20 de pacienți IBC și 50 de pacienți non-IBC au fost incluși în acest studiu. Cancerul mamar inflamator a fost diagnosticat conform criteriilor din sistemul de stadializare AJCC (American Joint Committee on Cancer) -TNM (Singletary et al, 2002). Toți pacienții cu IBC au prezentat mărirea difuză a debutului brusc afectat al sânului. Au fost raportate eritem și edem cutanat, care implică mai mult de o treime din sân. Prezența invaziei limfatice dermice ca observație izolată nu a fost suficientă pentru diagnosticarea IBC și nu a fost necesară pentru diagnostic. Un grup martor de non-IBC a fost comparat pentru histologia tumorii, expresia ER și amplificarea factorului de creștere epidermică umană 2 (HER2), dar nu și pentru stadiul tumorii pentru a identifica determinanții IBC adevărați. Caracteristicile tumorale sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabel în dimensiune completă

Izolarea totală a ARN-ului, sinteza complementară a ADN-ului și cuantificarea miARN

Statistică și bioinformatică

Pentru a reduce variația tehnică, au fost filtrate toate miARN-urile cu o limită de detecție de C (ciclu prag) mai mică de 35 cicluri PCR în cel puțin 25% din probe, rezultând o listă de 322 miARN informative. Apoi, am efectuat normalizarea între probe prin centrarea mediană a distribuției nivelurilor de expresie miARN pentru fiecare probă (Mestdagh și colab., 2009). Nivelul relativ de expresie miARN a fost calculat folosind metoda Att (Livak și Schmittgen, 2001).

Pentru a identifica tiparele de expresie miARN, am efectuat o analiză ierarhică completă neatinsă a clusterului folosind distanța euclidiană ca metrică de nepotrivire. Numărul de clustere de eșantioane robuste a fost determinat de algoritmul siluetei. Am investigat în continuare asocierea rezultatelor grupării probelor cu variabilele clinicopatologice folosind testul Pearson și testul global al lui Goeman (Goeman și colab., 2004).

Pentru a identifica miARN individual asociate cu IBC-uri, am selectat mai întâi toate miARN-urile care au fost semnificativ supraexprimate sau subexprimate în IBC-uri comparativ cu non-IBC-uri folosind un test non-parametric. Apoi, fiecare dintre aceste miARN a fost supus analizei de regresie multivariată cu starea N, starea M, stadiul tumorii și amplificarea HER2 ca covariabile. În acest fel, am putea identifica miARN care sunt asociați în mod specific cu IBC, mai degrabă decât diferențe în variabilele clinicopatologice între IBC și non-IBC, care sunt, de asemenea, cunoscute că afectează expresia miARN în cancerul de sân.

Pentru a examina relevanța biologică a miARN identificate, am adoptat strategia descrisă recent de Wang și colab (2009). În primul rând, pentru fiecare dintre miARN-urile care au fost asociate independent cu IBC-uri, am identificat un set de gene țintă presupuse folosind analiza corelației Spearman, luând în considerare atât corelațiile pozitive, cât și cele negative. Această analiză a fost efectuată pe un subgrup de 44 de probe (20 IBC și 24 de probe non-IBC) pentru care au fost disponibile profiluri de expresie genică Affymetrix HGU133 plus 2.0 (Van Laere și colab., 2007). Pentru a identifica ținte adevărate miARN, am comparat listele de ținte miARN prezumate cu liste de ținte miARN definite de TargetScan5.1 (//www.targetscan.org) utilizând analiza de îmbogățire a setului de gene a genelor hipergeometrice. Aceste miARN, pentru care țintele definite de TargetScan5.1 miARN au fost îmbogățite semnificativ pentru corelarea țintelor definite miARN, au fost supuse unei analize suplimentare. În plus, toate celelalte analize au fost efectuate numai pe genele comune dintre cele două seturi de ținte miARN. Aceste gene au fost analizate pentru categoriile îmbogățite de Ontologie genică (GO) și Enciclopedia Kyoto de gene și genomi (KEGG) prin analiza îmbogățirii setului de gene de gene hipergeometrice.

Pentru a verifica dacă miARN-urile identificate sunt relevante din punct de vedere prognostic, am descărcat șase seturi de date privind expresia genelor de pe site-ul web al Centrului Național pentru Biotehnologie (GSE7390, GSE9195, GSE1456, GSE11121, GSE2034 și GSE4922; //www.ncbi.nlm.nih). sunt disponibile publicului. gov). În plus, setul de date descris de van de Vijver și colab. (2002) a fost obținut de pe site-ul Rosetta (http://www.rii.com). În total, am analizat datele privind expresia ARNm din 1504 probe de cancer mamar. Pentru fiecare probă, am calculat scoruri, proporționale cu nivelul de expresie al miARN selectat, scăzând media țintelor miARN corelate negativ din media țintelor miARN corelate pozitiv. Aceste rezultate au fost standardizate (mediană = 0 și sd = 1) pentru a permite compararea între diferite seturi de date și analizate utilizând modelul de riscuri proporționale Cox atât în ​​setări univariate cât și multivariate. Variabila rezultată a fost supraviețuirea la distanță a metastazelor (DMFS, N = 1059), supraviețuirea globală (OS, N = 652) sau supraviețuirea fără recidive (RFS, N = 1145), dacă este posibil.

În cele din urmă, într-un subset de 44 de probe pentru care au fost disponibile profilurile de expresie genică Affymetrix HGU133 plus 2.0, am comparat expresia genelor de procesare miARN între IBC și non-IBC. Am analizat în continuare efectul supus reglării tuturor miARN-urilor din baza de date TargetScan5.1 asupra profilurilor de expresie genică din aceste 44 de probe. Am adoptat abordarea publicată recent de Cheng și colab. (2009) pentru a calcula scorul efectului de reglementare (RE) scăzând poziția medie a țintelor miARN din valoarea medie a țintelor non-miARN, cu valori RE ridicate care indică un efect puternic. miARN pentru expresia țintei și invers. Cu toate acestea, deoarece acest scor ține cont doar de țintele miARN reglementate negativ, am ajustat scorul RE în așa fel încât au fost luate în considerare atât efectele inhibitoare, cât și cele activatoare. Aceste scoruri RE au fost apoi comparate între IBC și non-IBC folosind un test non-parametric.

Toate analizele datelor au fost efectuate folosind un bioconductor în R (//www.bioconductor.org). Corecția pentru testarea multiplă a fost efectuată utilizând procedurile Benjamin și Hochberg pentru a crește frecvența falsurilor pozitive, iar valorile P 2 ajustate au arătat că gruparea eșantionului a fost asociată cu expresia ER (P = 0,011), gradul histologic al tumorii (P = 0,004)., Starea N (P = 0,014) și stadiul tumorii (P = 0,010). Nu s-a observat nicio asociere cu gruparea eșantionului pentru starea T și M, amplificarea HER2 sau subtipul tumorii (IBC sau non-IBC).

profil

Gruparea ierarhică a 20 IBC și 50 de probe non-IBC conform modelului de expresie a 50 miARN diferite. Valorile expresiei pentru aceste 50 miARN sunt reprezentate în format matricial, cu rânduri care indică miARN și bare care indică eșantioane. Valorile ridicate ale expresiei sunt colorate în roșu, iar valorile reduse ale expresiei sunt colorate în albastru. Au fost identificate trei grupuri robuste de probe care au fost semnificativ asociate cu expresia ER și gradul histologic. În special, primele două grupuri combinate (albastru și galben) de probe au fost îmbogățite pentru tumorile mamare ER + (80% din probe) comparativ cu al treilea grup (roșu) de probe (50% din probe) (P χ 2 = 0, 028), mai ales în primul În grupul de eșantionare (albastru), 20% din eșantioane au fost slab diferențiate comparativ cu 60% din eșantioanele din al doilea grup de eșantionare (galben) (P 2 = 0,004), indicând o divizare a Tumori de sân ER + în funcție de subtipul luminal A și luminal B. Nu s-a observat nicio asociere a grupării probelor cu diferența dintre IBC și non-IBC: 30, 25 și 45% din probele IBC grupate în primul (albastru), al doilea (galben) și al treilea (roșu) grupuri de probe (P = 2 = 0,082). (Reproducerea color a acestei imagini este disponibilă în versiunea completă html a manuscrisului.)

Imagine la dimensiune completă

Testul global al lui Goeman a fost efectuat pentru a determina asocierile expresiei miARN cu diferiți factori clinicopatologici (Tabelul 2) pentru un set de date redus constând din 50 miARN diferite. Au fost observate asociații semnificative pentru expresia ER și gradul histologic al tumorii, dar nu pentru starea T, N sau M, stadiul tumorii, amplificarea HER2 sau subtipul tumorii (IBC sau non-IBC). Astfel, cea mai mare diferență în expresia miARN în setul nostru de probe de cancer mamar s-a datorat diferențelor în expresia receptorilor de hormoni steroizi și histologia tumorii și nu diferențelor dintre IBC și non-IBC. De fapt, distribuțiile globale ale valorilor expresiei miARN în IBC și non-IBC arată foarte asemănător (Figura 2).

Tabel în dimensiune completă

Distribuția valorilor expresiei miARN în ( A ) tumori inflamatorii ale sânului și ( B ) a tumorilor mamare neinflamatorii.

Imagine la dimensiune completă

Asocierea miARN-urilor individuale cu cancer mamar inflamator

Analiza de regresie logistică a fost efectuată pentru a identifica diferențele în nivelurile de expresie miARN între probele IBC și non-IBC (tabelul 3). S-a observat că puțini miARN sunt asociați independent cu diferența dintre IBC și non-IBC. Expresia crescută a miR-335, miR-337-5p, miR-451, miR-486-3p, miR-520a-5p și miR-548d-5p a fost observată în subtipul IBC, în timp ce miR-15a, miR-24, miR -29a, miR-30b, miR-320, miR-342-5p și miR-432-3p au fost semnificativ subregulate în comparație cu non-IBC.

Tabel în dimensiune completă

O analiză similară a fost efectuată pentru a identifica diferențele în expresia miARN între probe în funcție de starea T (scăzut vs mare), starea N (pozitiv vs negativ), starea M, stadiul tumorii (scăzut vs ridicat), gradul tumorii (ridicat vs scăzut), ER expresie și amplificare HER2. Asociațiile miARN cu acești factori clinicopatologici sunt, de asemenea, enumerate în Tabelul 3.

Predicția țintelor miARN și implicarea lor în procesele biologice

Am investigat în continuare implicarea genelor țintă miARN în diferite procese biologice, care pot indica funcția miARN, adoptând o strategie descrisă recent de Wang și colab. (2009). Am efectuat mai întâi o analiză a coeficientului de corelație pentru a evalua corelațiile potențiale dintre nivelurile de expresie a 13 miARN asociate IBC (miR-335, miR-337-5p, miR-451, miR-486-3p, miR-520a-5p, miR -548d -5p, miR-15a, miR-24, miR-29a, miR-30b, miR-320, miR-342-5p și miR-342-3p) și niveluri de expresie a ARNm de 10.961 gene cunoscute într-un set redus de 44 de cancer probe de sân, dintre care 20 au fost IBC și 24 au fost non-IBC. Folosind o falsă măsură a descoperirii

Analiza Kaplan-Meier a supraviețuirii miR-520a-5p exprimarea genei țintă în cancerul de sân metastatic la distanță ( A A C ) și supraviețuirea generală ( B A D ) ca rezultat al. Curbele Kaplan-Meier sunt date pentru seturile de date ale lui Van de Vijver și colab. (2002) ( A A B ) și Desmedta și colab. (2007) ( C A D ).

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Exprimarea genelor de procesare miARN în cancerul de sân

Deoarece IBC este considerat un model de agresivitate a cancerului de sân, am fost interesați să stabilim dacă miARN-urile specifice IBC au fost asociate cu un prognostic neutru la pacienții fără IBC. Datorită numărului limitat de eșantioane clinice, am folosit o abordare indirectă și am corelat expresia genei miRNA țintă cu rezultatele pacienților folosind informații disponibile public din studii de microarray care ar putea fi extrase din baza de date a expresiei genice. Această analiză a demonstrat o asociere puternică a expresiei genei țintă miR-520a-5p cu DMFS, RFS sau OS mai scurte în majoritatea seturilor de date de cancer mamar examinate. Acest rezultat demonstrează rolul posibil al miR-520a-5p ca factor de prognostic în cancerul de sân. Recunoscând limitările utilizării abordării indirecte, aceste tipuri de teste pot ajuta la îndrumarea viitoarelor studii la scară largă cu privire la valoarea prognostică a miARN-urilor în cancerul de sân.

În concluzie, acest studiu, după cunoștințele noastre, reprezintă prima analiză integrată a expresiei miARN și mARN în IBC. Am identificat numărul de miARN care sunt exprimate diferențial între IBC și non-IBC. Am raportat în continuare expresia modificată a genelor de procesare a miARN în IBC comparativ cu non-IBC. În cazul a patru dintre miARN-urile legate de IBC, am reușit să detectăm diverse procese biologice care pot indica funcția acestor miARN și pot indica asocierea lor potențială cu prognosticul cancerului de sân pe baza nivelurilor de expresie ale genelor lor țintă.