obiecte

abstract

Pentru acest studiu, am folosit paradigma PAS stabilită (cu procedura de condiționare olfactivă) pentru a elucida efectul modulator al semnalizării receptorilor CB1 în procesarea recompensării hedonice. Deoarece PAS a fost evaluat până acum doar la șobolani, un alt scop al acestui studiu a fost de a determina și confirma o paradigmă la șoarecii de laborator. Expunerea la stimuli naturali și abuzul de droguri duce la schimbări neuroplastice legate de recompensă în regiunile creierului și am demonstrat recent că prezentarea acută a unui stimul olfactiv gustativ la șobolani stimulează gena c-Fos timpurie imediată în zonele striatale (Friemel și colab., 2010). În acest studiu, am căutat să ne extindem concluziile pentru a examina implicarea altor factori de transcripție. Pentru a investiga diferențele potențiale în procesarea recompensei neuronale la șoarecii WT și KO, am examinat în plus capacitatea mirosului condiționat de a stimula expresia strosului FosB/AFosB.

SUBIECTE ȘI METODE

obiecte

Un total de 132 de animale au fost utilizate pentru acest studiu. Șobolani adulți masculi Wistar au fost cumpărați de la Wistar Harlan Laboratories (AN Venray, Olanda). Șoarecii masculi adulți de tip sălbatic (WT) și CB1 (CB1 KO) cu fundal genetic C57BL/6J crescut la Universitatea din Bonn (Zimmer și colab, 1999) au fost transportați la Mannheim (Germania). Animalelor li s-a permis să se recupereze din transport și au fost obișnuiți cu noul mediu timp de cel puțin 7 zile după sosire. Toate animalele utilizate în prezentele experimente au fost potrivite în funcție de vârstă (șobolani: 4 luni; șoareci: 2 până la 3 luni). Șoarecii au fost adăpostiți individual pentru a evita frizerul și comportamentul agresiv în cuștile Makrolon (Eurostandard tip II), iar șobolanii au fost adăpostiți în grupuri de patru (Eurostandard tip IV) într-o cameră pentru animale într-o colonie de 12 ore întuneric deschis (lumini la 07:00 - 1900 ore). Animalele au primit acces gratuit la apă și furaje standard de laborator în prima săptămână după sosire și au fost menținute la aproximativ 95-97% din greutatea corporală în timpul testării comportamentale atunci când a fost furnizat lapte condensat îndulcit bogat în calorii.

Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu Manualul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, așa cum a fost adoptat și declarat de Institutul Național de Sănătate și aprobat de comitetul local de îngrijire a animalelor (Karlsruhe, Germania).

Proiectare experimentală

În primul experiment, am investigat efectele antagonistului receptorului CB1/agonistului invers SR141716 (SR; Rimonabant) și al agonistului sintetic al receptorilor canabinoizi WIN 55 212-2 (WIN) asupra procedurii PAS bine stabilite la șobolani. Prin urmare, șobolanii au primit o singură injecție de 1 mg/kg SR/vehicul sau 0,3 mg/kg WIN/vehicul în timpul antrenamentului (experiment SR: SR n = 16, vehicul n = 12; experiment WIN: WIN n = 9, vehicul n = 12 ). După cum se știe, prima injecție de agoniști canabinoizi la rozătoarele medicamentoase netratate anterior poate fi percepută ca aversivă (Schneider și Koch, 2002; Chaperon și Thiebot, 1999), în plus, animalele din experimentul WIN au primit o singură injecție primară . 0,3 mg/kg WIN, cu 48 de ore înainte de începerea procedurii de instruire PAS. Pentru a exclude că administrarea cronică SR/WIN poate afecta amplitudinea ASR în sine, am evaluat suplimentar ASR într-o altă cohortă de animale care nu au fost supuse antrenamentului de asociere a recompenselor. Aceste animale au fost, de asemenea, testate de două ori pentru ASR: o dată înainte și o dată după administrarea cronică a medicamentelor WIN/SR sau a vehiculului adecvat (experiment WIN: WIN n = 6, vehicul: n = 9; experiment SR: SR n = 6, vehicul: n = 7).

Următoarele experimente au fost efectuate pe șoareci CB1 KO și pe colegii lor WT respectivi. Prima cohortă de șoareci WT/KO a fost utilizată pentru a testa comportamentul. Grupa I a fost testată pentru laptele condensat îndulcit (SCM), PAS și rolul preferențial al mirosului (WT și CB1 KO: n = 11). Între testele de comportament, animalele au fost lăsate nestingherite timp de 3 până la 4 zile. Grupul II a fost instruit în mod fals și a servit drept control în timpul testării PAS (WT și CB1 KO: n = 7). O a doua cohortă de șoareci a fost utilizată pentru experimentul FosB/AFosB (WT: antrenat și simulat antrenat: n = 5; CB1 KO: antrenat n = 4, antrenament simulat n = 5).

O sticlă SCM (Nestle AG, Frankfurt, Germania; diluată 1: 3 cu apă de la robinet) a fost utilizată pentru toate experimentele comportamentale ca recompensă pentru masă. Toate animalele au fost obișnuite cu SCM în cușca de acasă timp de 24 de ore cu cel puțin 4 zile înainte de începerea testării comportamentale sau a antrenamentului pentru a evita neatenția la recompensa indusă de noutate.

droguri

SR (în general furnizat NIMH) este dizolvat în etanol și Tween-80 și apoi diluat cu soluție salină (1: 1: 18). WIN (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania) a fost dizolvat în 0,1% Tween-80 și diluat în soluție salină (0,9%). Ambele medicamente au fost administrate intraperitoneal în doză de 1 mg/kg (SR) și 0,3 mg/kg (WIN). SR a fost injectat 30 de minute și WIN imediat înainte de antrenament cu un volum de injecție de 1 ml/kg.

Testarea comportamentului

PAS la șobolani

Testele PAS au fost efectuate într-o cameră surpriză (SR-LAB; San Diego Instruments, San Diego, CA) așa cum este descris mai sus (Schneider și Spanagel, 2008; Schneider și colab., 2010; Brand și colab, 2012). Un impuls de zgomot alb (40 ms, nivel de presiune acustică 100 dB (SPL)) a fost folosit ca impuls de stimul pentru a testa frica. Un timp de aclimatizare de 5 minute, timp în care șobolanii nu au primit stimul, cu excepția zgomotului de fond (60 dB), a fost urmat de prezentarea a cinci stimuli inițiali. Următorul protocol de test a constat din 30 de impulsuri tresărite cu un interval intertrial distribuit aleatoriu între 10 și 20 s. Testele surpriză au fost efectuate de două ori în prezența indicilor de miros (portocaliu, uleiuri esențiale; Primavera Life, Sulzberg, Germania), o dată înainte (ASR de bază; ASR1) și din nou 48 de ore după antrenamentul de asociere a mirosurilor (ASR2). Mirosul (30 μl) a fost furnizat într-o cutie Petri, care a fost plasată într-o cutie surpriză în timpul obișnuinței. PAS a fost calculat ca procent mediu de scădere față de amplitudinea ASR inițială (100- (100x amplitudine medie ASR2/amplitudine medie ASR1 (linia de bază)).

Pregătirea pentru remunerare a durat 5 zile. În timpul fiecărui antrenament zilnic de 90 de minute, șobolanii au fost așezați în cuști separate (Eurostandard tip III) și au prezentat trei prezentări de miros la momente aleatorii. Mirosul (portocaliu, 15 μl) a fost adăugat la o mică casetă Petri plasată în centrul capacului de sârmă, la 2 cm sub deschiderea sticlei de băut SCM. După accesul gratuit la recompensă timp de 5 minute, mirosul și sticla au fost eliminate. Cu 30 de minute (experiment SR) sau direct (experiment WIN) înainte de începerea fiecărui antrenament, toate animalele au primit o injecție cu medicamentul sau vehiculul corespunzător.

PAS la șoareci CB1 KO și WT

Testele de tresărire la șoareci nu au diferit de protocolul descris mai sus pentru șobolani, cu excepția intensității de tresărire (115 dB SPL). Pregătirea asociativă la șoareci a durat 5 zile și a fost ușor diferită de protocolul nostru pentru șobolani. Instruirea a fost efectuată în cuști de șoarece domestice. Într-un interval de timp zilnic de 6 ore (de la 1000 la 1600 de ore), toți șoarecii au experimentat cinci prezentări de recompensă a mirosului în momente aleatorii. Mirosul (portocaliu, 15 μl) a fost furnizat într-o mică cutie Petri situată în mijlocul capacului de sârmă, la 2 cm sub deschiderea sticlei. După accesul gratuit la recompensă timp de 5 minute, mirosul și sticla au fost eliminate.

Pentru a valida noul protocol PAS la șoareci, un grup suplimentar a fost testat în condiții simulate. Aceste animale au fost supuse unei proceduri de antrenament de simulare, în care li s-a acordat acces la SCM timp de 5 zile zilnic timp de 25 de minute în momente aleatorii, fără prezentarea concomitentă a mirosului. Expunerea la miros a fost efectuată într-o manieră decuplată cel puțin 4 ore după/înainte de abordarea SCM.

Absorbție limitată a SCM la șoarecii CB1 KO și WT

Animalele au fost testate pentru admisia SCM în cușca lor de acasă. În ziua testului, s-a măsurat greutatea corporală (BW) și animalele au fost așezate înapoi în cușca lor de acasă. Aici li s-a oferit acces gratuit la sticla SCM timp de 30 de minute. Aportul de SCM a fost apoi calculat ca aport de g per kg BW.

Test de preferință a mirosului la șoarecii CB1 KO și WT

Rolul preferinței mirosului în câmp deschis (20 × 20 x 25 cm 3) a fost utilizat pentru a evalua capacitatea de a detecta mirosul la șoarecii CB1 KO. În timpul testării, două aruncătoare de sare din sticlă în formă identică (cu capace metalice perforate) conținând hârtie de filtru înmuiată în 15 μl de apă sau ulei de lămâie au fost plasate în arenă. Șoarecii au fost obișnuiți cu arena și subiecți (necentrați) timp de 10 minute 24 de ore înainte de testare. Pentru a testa preferința obiectului, șoarecilor li s-a permis să examineze liber parfumurile timp de 6 minute. Animalele au fost înregistrate video și timpul (timpul) de sondaj al fiecărui obiect au fost analizate de un experimentator offline orbit de genotipul șoarecelui. Pentru a calcula procentul de discriminare a mirosului, timpul de inspecție a parfumurilor de lămâie a fost exprimat ca procent din timpul total de inspecție a ambelor obiecte.

imunohistochimie

Stimularea FosB/AFosB și pregătirea creierului

Pentru a măsura expresia proteinei FosB/AFosB, șoarecii au fost instruiți (sau au fost antrenați dacă este necesar) timp de 5 zile pentru a asocia un parfum portocaliu cu prezența SCM, așa cum este descris mai sus pentru protocolul de antrenament PAS. Toate animalele au fost expuse la miros portocaliu (15 μl) timp de 10 minute 48 de ore după ultimul antrenament de asociere. Animalele au fost sacrificate 90 de minute mai târziu prin decapitare și creierele au fost îndepărtate, congelate rapid în metilbutan timp de 90 de secunde și depozitate la -80 ° C. Creierele înghețate au fost tăiate în secțiuni coronare groase de 12 mm pe criostate și imediat decongelate pe lamele Superfrost și depozitate. la -80 ° C. Două regiuni cerebrale legate de recompensă, nucleul accumbens (NAC) și striatul dorsal (dStr), au fost selectate ca regiuni de interes.

Imunohistochimie FosB/AFosB

Lamelele au fost decongelate și uscate la temperatura camerei înainte de fixare în 4% PFA. Diapozitivele au fost spălate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și PBS cu 0,1% Tween-20 (PBS-T). După 30 de minute de incubare cu 0,2% H2O2 dizolvat în metanol și spălare ulterioară în PBS/PBS-T, anticorpul monoclonal FosB primar (Nr. 2251; New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Germania), care recunoaște atât FosB, cât și Proteine ​​AFosB, au fost incubate la o concentrație de 1: 400 în PBS cu 0,2% ser normal de capră peste noapte la 4 ° C. Diapozitivele au fost spălate din nou în PBS/PBS-T și tratate în continuare cu trusa ABC de iepure IgG Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA) conform instrucțiunilor producătorului. Diapozitivele au fost incubate cu anticorp secundar timp de 1 oră la temperatura camerei, spălate și tratate cu avidină și biotină timp de 1 oră la temperatura camerei. Secțiunile au fost apoi spălate și colorate imunohistochimic cu diaminobenzidină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) și transferate într-o serie treptată de soluții de etanol și xilen înainte de a fi acoperite în Eukitte (O Kindler GmbH, Freiburg, Germania).

analize statistice

Efectele farmacologice ale WIN și SR asupra procentului de PAS la șobolani instruiți și neinstruiți au fost analizați prin analiza bidirecțională a varianței (ANOVA), respectiv. Efectele genotipului (WT/KO) asupra performanței comportamentale au fost evaluate utilizând testele t Student, cu excepția cursului de timp al ASR și PAS la șoarecii KO și WT. Aceste date, precum și absorbția SCM în timpul antrenamentului PAS în experimentele WIN și SR, au fost analizate prin măsuri repetate ANOVA utilizând testul Student-Neuman-Keuls ca analiză post hoc. Stimularea FosB/AFosB indusă de miros în NAC și dStr a fost analizată pentru fiecare genotip folosind testele t Student. Conform constatărilor noastre anterioare privind stimularea c-Fos (Friemel și colab., 2010), ne-am așteptat să observăm o expresie crescută a FosB/AFosB după antrenamentul mirosului la animalele WT. Din acest motiv, s-au aplicat teste t unilaterale pentru a analiza datele la șoareci WT. Toate datele sunt exprimate ca medie ± SEM. Nivelul de semnificație statistică a fost definit ca p

important

Relief atenuat plăcut (PAS), răspuns acustic la tresărire (ASR) și aport de lapte condensat îndulcit (SCM) la șoareci CB1 knockout (KO) și de tip sălbatic (WT). Am observat un răspuns PAS stabil la șoareci WT; cu toate acestea, la șoarecii CB1 KO, PAS sa dovedit a fi aproape absent (a). Pentru a controla potențialele variații ale obiceiului de tresărire între sesiunile de testare, o a doua cohortă de șoareci KO și WT au fost supuse unei proceduri simulate de antrenament fără miros și testate conform protocolului PAS. Nu s-au observat diferențe între genotipuri, indicând o repetare similară a ASR după teste repetate la animale CB1 KO și WT (b). Tabăra de miros condiționat a atenuat magnitudinea ASR la animalele WT în timpul celui de-al doilea tresărit (c), în timp ce nu a fost observată o astfel de reducere la șoarecii CB1 KO (d). Cursul de timp în procente de PAS a fost semnificativ mai mic la șoarecii CB1 KO pe parcursul sesiunii de testare (e). În cele din urmă, absorbția gratuită a SCM a fost redusă la șoarecii CB1 KO comparativ cu controalele WT (f). Datele sunt exprimate ca medie ± SEM (p

Preferința mirosului la șoarecii knockout CB1 (KO) și de tip sălbatic (WT). Ambele genotipuri au arătat o preferință similară pentru obiectul parfumat în timpul testării discriminării mirosului, indicând o capacitate comparabilă de a simți mirosul la animalele CB1 KO și WT. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM (WT și CB1 KO: n = 11).

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Stimularea FosB/AFosB indusă de miros la șoarecii CB1 KO și WT

Exemplul de colorare FosB/AFosB dStr de la animale controlate cu miros și simulate controlate de ambele genotipuri este prezentat în Figura 4. Inducerea expresiei FosB/AFosB prin tabără de miros a fost semnificativ mai mare la șoarecii WT care au urmat antrenament de asociere a recompensei. la șoareci cu antrenament simulat în NAC (t 8 = -1, 99, p = 0,04) (Figura 5a) și dStr (t8 = -1, 91, p = 0,047) (Figura 5b). Cu toate acestea, nu s-a observat o astfel de diferență la șoarecii CB1 KO (NAC: t7 = 0,88, p = 0,41; dStr: t7 = -0,21, p = 0,84) (Figurile 5c și d), indicând faptul că mirosul asociat cu expunerea acută la recompensă nu conduc la stimularea semnificativă a zonelor cerebrale legate de recompensă la animalele antrenate CB1 KO.

Site-uri de eșantionare striatală și colorare exemplară FosB/AFosB. Schema creierului coronal ilustrează poziția stabilă a granulelor de eșantionare (500 × 500 μm 2) pentru striatul dorsal (dStr) și nucleul accumbens (NAC) în planul secțiunii corespunzător +1, 45 la +1, 35 din Bregma. Colorarea reprezentativă FosB/AFosB dStr de la șoareci cu miros simulat și miros al ambelor genotipuri este prezentată în dreapta.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Stimularea FosB/AFosB prin prezentarea mirosului poftei de mâncare la șoarecii CB1 knockout (KO) și de tip sălbatic (WT). S-a constatat că eticheta de miros condiționat crește semnificativ expresia FosB/AFosB la animalele WT antrenate în nucleul accumbens (NAC) (a) și striatul dorsal (dStr) (b) comparativ cu controalele tratate fals. Nu s-a putut observa o astfel de expresie crescută pentru șoarecii CB1 KO, fie în NAC (c), fie în dStr (d). Datele sunt exprimate ca medie ± SEM (p