obiecte

abstract

Diabetul de tip 2 este o tulburare metabolică cronică care este cauzată în primul rând de rezistența la insulină, principalul factor care contribuie la aceasta este obezitatea. Nivelurile de expresie ale receptorilor cuplați la proteina G orfană (GPCR), GPR21, au demonstrat o tendință spre o creștere semnificativă a tampoanelor de grăsime epididimale la șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi, cu conținut ridicat de grăsimi (HFHS). Pentru a obține o perspectivă suplimentară asupra rolului potențial pe care această nouă țintă îl poate juca în dezvoltarea diabetului de tip 2 asociat cu obezitatea, au fost investigate capacitățile de semnalizare a receptorilor. Studiile de supraexprimare în celulele HEK293T au arătat că GPR21 este un receptor constitutiv activ care se leagă de proteinele G qq de tip G, ducând la activarea protein kinazelor activate cu mitogen (MAPK). Supraexprimarea GPR21 in vitro, de asemenea, a atenuat semnificativ semnalizarea insulinei. Interesant, efectul GPR21 asupra semnalizării MAPK și insulinei a fost redus în prezența serului, rezultând posibilitatea unui ligand inhibitor nativ. Modelarea omologă și studiile de legare a ligandului au condus la identificarea unui compus nou care inhibă activitatea GPR21. Efectele sale oferă potențial ca strategie farmacologică antidiabetică, deoarece s-a demonstrat că contracarează efectul GPR21 asupra căii de semnalizare a insulinei.

Diabetul de tip 2 este cauzat în primul rând de o afecțiune sistemică rezistentă la insulină cauzată de creșterea țesutului adipos vâscos, care declanșează inflamații cronice, de grad scăzut, care afectează negativ calea de semnalizare a insulinei 1, 2. Incidența crescândă a diabetului de tip 2, împreună cu limitările regimurilor curente de tratament, necesită strategii inovatoare și eficiente pentru a preveni dezvoltarea și progresia acestei boli. Receptorii cuplați cu proteina G (GPCR), cea mai mare superfamilie proteică din genom, sunt o sursă bogată de ținte medicamentoase, deoarece transmit cu ușurință semnale externe către mediul intern al celulei: aproximativ 30-40% din medicamentele comercializate vizează acești receptori universali 3 .

Am observat o creștere a nivelurilor de expresie a GPCR, GPR21, în țesutul adipos al șoarecilor cu conținut ridicat de zahăr (HFHS). Deși această creștere nu a atins un nivel semnificativ din punct de vedere statistic, GPR21 poate reprezenta un nou mijloc prin care fenotipul țintă de tip 2 ar putea fi vizat, deoarece acest GPCR a fost conceput pentru a se asocia cu proteinele G q q subtipul G, Gaq10 și Ga15/16 11. Progresele în modelarea omologiei și studiile de andocare a ligandilor au facilitat foarte mult dezvoltarea de terapii țintite pentru GPCR orfani 12. Deoarece structura GPR21 rămâne necunoscută, aceste tehnici au fost utilizate pentru a identifica potențiale molecule mici capabile să lege și să regleze efectele acestui receptor.

Această lucrare oferă o analiză a transducției semnalului indusă de GPR21, care oferă o imagine de ansamblu asupra mecanismelor prin care acest receptor ar putea acționa asupra fenotipului diabetic de tip 2 și, astfel, poate reprezenta o oportunitate pentru o nouă strategie terapeutică. Activitatea constitutivă observată a GPR21, care promovează activarea MAPK și afectează negativ calea de semnalizare a insulinei, poate fi reglată de ligandul nativ prezent în ser. În plus, s-a descoperit că un nou compus conceput să se lege de GPR21 protejează împotriva efectelor observate ale receptorului asupra căii de semnalizare a insulinei.

Rezultatul

GPR21 este un semnal receptor constitutiv activ prin Ga15/16

obiectiv

Tampoanele de grăsime epididimale de control și șoarecii C57BL/6J alimentați cu HFHS au fost lizați, proteinele separate prin SDS-PAGE și expresie ( A ) GPR21 a ( b ) a unui marker macrofagic, F4/80, evaluat prin Western blot. Western blots reprezentative sunt prezentate împreună cu densitățile relative determinate utilizând software-ul Image J, prezentat ca medie ± SEM, n = 9. O creștere semnificativă a expresiei F4/80 a fost observată prin testul t al Studentului nepereche la p

Imagine la dimensiune completă

Deoarece supraexprimarea GPR21 a cauzat o creștere semnificativă a fosforilării JNK, a fost evaluat efectul receptorului asupra căii de semnalizare a insulinei. Celulele HEK293T care supraexprimă GPR21 nu au răspuns la stimularea receptorilor indusă de insulină, rezultat care a scăzut ușor în prezența serului (Fig. 2e). În aval de calea GPR21, supraexpresia a împiedicat fosforilarea IRS1, Akt și AS160 în prezența și absența insulinei. Acest rezultat a fost redus din nou când celulele au fost incubate cu mediu care conține ser. Un rezultat asociat a fost observat atunci când GPR21 a fost asociat cu Ga 15/16 (Fig. 2f), deși efectul serului a fost ușor. Datorită căii de semnalizare a insulinei atenuate, GPR21 a provocat, de asemenea, o scădere semnificativă a absorbției de glucoză, care a fost parțial izolată în prezența serului (Fig. 2g). Când a fost co-exprimat cu G15 15/16, s-a observat o tendință similară (Fig. 2h). Efectul GPR21 asupra căii de semnalizare a insulinei nu se limitează la celulele HEK293T, deoarece acest efect poate fi observat și în celulele CHO care supraexprimă receptorul (vezi figura suplimentară S1).

Noul compus protejează împotriva efectelor GPR21

Această lucrare demonstrează rolul potențial pe care GPR21 îl poate juca în dezvoltarea diabetului de tip 2 (Fig. 4). Diabetul de tip 2 indus de obezitate poate fi asociat cu dereglarea GPR21 prin expresia crescută a receptorilor, agonist endogen crescut sau agonist invers redus, ducând la stimularea MAPK care contribuie la efectele inhibitoare ale GPR21. Direcționarea GPR21 cu un agonist invers, precum cel identificat în acest studiu, ar putea limita unele dintre numeroasele aspecte care contribuie la dezvoltarea rezistenței la insulină și a diabetului de tip 2.

GPR21 activ constitutiv achiziționează și activează G15 15/16, ceea ce facilitează hidroliza PIP 2 în DAG și IP3 de către PLC. Atât DAG cât și IP 3 activează PKC, care semnalizează și activează cascada MAPK. MAPK JNK joacă un rol cheie în dezvoltarea rezistenței la insulină, deoarece promovează fosforilarea unei componente cheie a cascadei de semnalizare a insulinei, IRS1, în Ser 307, prevenind astfel fosforilarea tirozinei indusă de insulină. Activarea MAPK indusă de GPR21 poate contribui la dezvoltarea diabetului de tip 2. Datorită potențialului agonistului invers nat în ser, se consideră că transducția semnalului GPR21 este bine reglată în condiții fiziologice normale. Cu toate acestea, în obezitate, creșterea activității GPR21 poate deveni dăunătoare, favorizând potențial dezvoltarea rezistenței la insulină.

Imagine la dimensiune completă

metode

Șoarecii masculi C57BL/6J la vârsta de 4 săptămâni (n = 18 furnizați de Charles River, Calco, Lecco, Italia) au fost adăpostiți într-un mediu controlat de temperatură cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Animalele au fost menținute pe o dietă cu pelete timp de 1 săptămână, apoi au fost împărțite aleatoriu în două grupe: o dietă normală (martor, n = 9) și o dietă bogată în zahăr, bogată în zahăr (HFHS, n = 9) timp de 16 săptămâni. Dieta HFHS conținea 45% kcal grăsimi, 35% kcal carbohidrați și 20% kcal proteine ​​(D12451, ssniff Spezialdiäten GmbH, Germania). Procedurile utilizate în acest studiu au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din cadrul Universității din Torino și ulterior de Comitetul de etică al Universității Naționale din Irlanda, Maynooth (BSRESC-2014-008). Protocoalele au fost în conformitate cu Directiva europeană 2010/63/UE privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice.

Cultură celulară, transfecție și tratament

Celulele HEK293T au fost menținute în mediu complet (mediul de glucoză Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) conținând 2 mM L-glutamină și 100 ug/ml penicilină-streptomicină) suplimentat cu 10% (v/v) ser fetal bovin (FBS) (Sigma) la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO 2. Celulele au fost transfectate cu 2 μg de GPR21 uman conținând o etichetă myc încorporată în terminalul C sau vector gol, pCMV6-Entry (OriGene Technologies), cu Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) conform protocoalelor producătorului. Când a fost co-transfectat cu ADNc corespunzător subunităților α ale proteinei G, Gaq, Ga15/16 și Ga14 (Centrul de resurse ADNc), s-a folosit 1 μg din fiecare plasmidă. Celulele au fost incubate timp de 24 de ore la 37 ° C pentru a permite încorporarea ADN-ului plasmidic. Pentru a determina efectul serului asupra activității GPR21, celulele au fost incubate pentru încă 24 de ore cu mediu complet proaspăt ± 10% (v/v) FBS. Tratamentul cu compuși (GF109203X, U73122 și SP600125, Sigma) a fost efectuat într-un mediu complet fără ser. Pentru a determina efectul GPR21 asupra semnalizării insulinei, celulele HEK293T au fost stimulate cu insulină 100 nM (Sigma) în tamponul Kreb's Ringer (KRB); 136 mM NaCI, 20 mM HEPES, 4,7 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 1 mM CaCl 2, 4,0 mM Na 2 HPO 4, 0,95 mM NaH 2 PO 4, pH 7,4, conținând 5 mM glucoză timp de 1 oră la 37 ° C,

Inositol fosfat (IP-one) timp de fluorescență omogen (HTRF)

Nivelurile IP 1 celulare au fost măsurate folosind kitul de testare HTRF IP-one (Cisbio) 13. Pe scurt, celulele subconfluente au fost separate de vasul de cultură celulară prin tripsinizare și resuspendate într-un volum adecvat de tampon de stimulare a testului (10 mM HEPES, 1 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2, 4,2 mM KCl, 146 mM NaCl, 5,5 mM glucoză) . LiCl 50 mM, pH 7,4) este încălzit la 37 ° C până la o concentrație de 6 x 106 celule/ml. Suspensia celulară a fost adăugată la o placă albă de 384 godeuri cu jumătate de volum (Greiner) împreună cu compusul testat și incubată la 37 ° C timp de 2 ore. S-a adăugat tampon de liză IP-unu conținând 5% conjugat IP-unu-d2 la godeurile corespunzătoare, urmat de 5% conjugat anti-IP-unu Tb criptat. Probele au fost incubate în întuneric timp de 1 oră la temperatura camerei. Placa a fost citită pe o placă BMG labte cu plăci excitate la 340 nm și emise la 615 nm și 665 nm. Rapoartele de transfer al energiei prin rezonanță de fluorescență (FRET) (665 nm/615 nm) au fost convertite în concentrații IP 1 prin interpolare a valorilor din curba standard IP 1. .

Pregătirea lizatelor și analiza Western blot

Tampoanele de grăsime epididimale de șoarece congelate au fost omogenizate în tampon de liză rece ca gheața (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCI, 50 mM NaF, 1 mM EGTA, 1,5 mM MgCl 2, 2 mM Na 3 VO 4, 10% (v/v ). vol.) glicerol, mM Na 4 P 2 O 7, 1 mM PMSF, 1X cocktail SigmaFAST inhibitor de protează și 1% (v/v) Triton x-100) într-un raport de 1: 5 (w: v) folosind un omogenizator de bază T10 de mână (IKA). Celulele au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat rece ca gheața (PBS), apoi resuspendate în tampon de liză. Extractele brute au fost incubate timp de 1 oră la 4 ° C sub agitare. Probele au fost centrifugate la 17.000 x g timp de 10 minute la 4 ° C, granulele insolubile au fost îndepărtate și concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind testul de proteină Pierce (PN22660).

Lizatele cu aceeași concentrație de proteine ​​au fost separate prin SDS-PAGE, transferate la o membrană PVDF și blocate timp de 1 oră în soluție salină tamponată cu Tris (NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,6) cu 0,1% (v/v) Tween -20, conținând 5% (greutate/volum) de ser albumină bovină (BSA). Membranele au fost incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4 ° C, urmate de anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean timp de 2 ore la temperatura camerei. Benzile proteice au fost vizualizate pe film cu raze X cu chemiluminescență crescută (Roche). Imunodetecția a fost realizată folosind următorii anticorpi de la Cell Signaling Technology; fosfo-PKCs Thr 505 (9374), fosfo-Erk Thr 202/Tyr 204 (4370), Erk (4695), fosfo-p38 Thr 180/Tyr 182 (4511), p38 (9212), fosfo-JNK Thr 183/Tyr 185 (4668), JNK (9258), receptor fosfo-insulină p Tyr 1150/1151 (3024), IRS1 (3407), fosfo-Akt Ser 473 (9271), Akt (9272), fosfo-AS160 Thr 642 (8881), fosfo-AS160 Ser 588 (8730), AS160 (2670) și myc (2276). Phospho-IRS1 Tyr 612 (44-816G) a fost furnizat de Life Technologies și receptorul de insulină β (ab69508), GPR21 (ab139654), F4/80 (ab74383) și β-actină (ab8226) au fost cumpărate de la Abcam.

Absorbția 2-dezoxiglucozei

Absorbția glucozei a fost măsurată în conformitate cu Yun și colab. 18, cu modificări. Celulele HEK293T transfectate au fost spălate o dată cu KRB încălzit la 37 ° C, apoi incubate cu 1 μCi/ml [3 H] -2-deoxiglucoză (PerkinElmer, NET328A001MC) preparate în KRB la 37 ° C timp de 10 minute. Pentru a finaliza testul, celulele au fost spălate de trei ori cu KRB rece ca gheața și lizate în SDS 0,1% (greutate/volum) la 37 ° C timp de 30 de minute. Lizatele celulare au fost diluate 1: 4 în fluid de scintilație β (Beta-Plate Scint, PerkinElmer). Incorporarea [3H] -2-deoxiglucozei a fost cuantificată utilizând un contor Wallac 1450 Microbeta lichid de scintilație (PerkinElmer), exprimând rezultate în număr pe minut (CPM). Conținutul total de proteine ​​a fost determinat prin procedura de acid bicinchoninic 19 pentru a defini rezultatele ca CPM/mg.

Modelarea și andocarea ligandului omolog GPR21

Modelul structural intern GPR21 a fost construit folosind software-ul Modeller încorporat în Biovia Discovery Studio 20. Comparațiile secvenței au fost construite între secvența de aminoacizi a șabloanelor GPCR (2RH1 21, 4GBR 22) cu hGPR21 (cod de acces Swissprot Q99679) și verificate manual pentru a confirma alinierea corectă a reziduurilor conservate 23. Folosind alinierea, au fost create 1000 de modele diferite cu un protocol de rafinare ulterior aplicat zonelor buclelor 24, 25. Legături disulfurice s-au format între Cys 102 și Cys181. Modelul final a fost selectat folosind scorul obiectivului Modeller și o selecție de instrumente de evaluare a proteinelor (//services.mbi.ucla.edu/SAVES/) 26, 27 .

Folosind acest model proteic dezvoltat, au fost implementate procese de screening virtual pentru examinarea bazelor de date mari de baze de date (de exemplu Specs, www.specs.net) în silico prin studii de andocare moleculară (OpenEye, Fred 28, 29, 30). Moleculele au fost standardizate și tautomerii și stereoizomerii au fost calculați utilizând un Biovia Pipeline Pilot 20. Conformatorii au fost generați folosind Omega 31, 32, 33 de la Openeye înainte de andocare folosind parametrii standard cu Fred 29 și punctarea cu funcția de punctare chemgauss3. Din lista de mai sus, 11 compuși au fost ordonați pentru validare experimentală.

Analiza datelor

Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Testul t al Studentului nepereche a fost utilizat pentru a determina semnificația între grupuri. Analiza unică a varianței (ANOVA) cu testul Tukey post-hoc a fost utilizată pentru a determina semnificația între trei sau mai multe grupuri. Semnificația a fost indicată ca p