grăsime

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Modificări ale mucoasei colonice după o modificare a dietei
  • Modificări ale metabolismului microbian al colonului după o modificare a dietei
  • Modificări globale ale metabolismului după o modificare a dietei
  • Asocieri globale de microbi și metaboliți
  • Dieta cu conținut scăzut de fibre și metaboliți microbieni cu conținut ridicat de grăsimi
  • discuţie
  • metode
  • Design de studiu
  • Subiecte și recrutare
  • proiecție
  • Eligibilitatea subiectului
  • Prelevare și colonoscopie de fecale, colon și mucoase
  • Măsurarea biomarkerilor mucoasei
  • imunohistochimie
  • Cuantificarea colorării imunohistochimice
  • Ki67
  • CD3
  • CD68
  • Analiza țintită a microbilor fecali și colonici și a metaboliților de interes special
  • Aminoacizi plasmatici
  • analize statistice
  • Analiza globală a compoziției și diversității microbiotei
  • Analiza HITChip
  • Analiza rețelei de co-apariție microbiană
  • Analiza globală a metabolomului: pregătirea probei pentru analiza spectroscopică RMN
  • Spectroscopie 1 H RMN
  • Analiza datelor statistice multivariate
  • Generarea de rețea de reacție metabolică
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Cancer de colon
  • epidemiologie
  • Nutriție
  • Factori de risc

abstract

Din rezultatele a două studii publicate recent la om, știm că modificările conținutului de fibre și grăsimi ale dietei au un efect major asupra microbiotei din colon în câteva zile 11, 12. Aici, oferim informații critice cu privire la semnificația funcțională a acestor modificări ale microbiotei asupra mucoasei colonului prin modificarea raportului grăsime în fibre din cele două tipuri de cancer de colon cu risc ridicat și scăzut. Folosind designul studiului prezentat în Tabelul 1, am demonstrat creșterea așteptată a fermentației zaharirolitice și a butirogenezei și suprimării sintezei secundare a acidului biliar produsă de tranziția afro-americanilor la o dietă bogată în fibre, cu conținut scăzut de grăsimi pe parcursul a 2 săptămâni, asociată cu o reducerea semnificativă a biomarkerilor de inflamație și proliferare grosieră.riscul intestinului de cancer. În schimb, schimbarea dietei din africanii din mediul rural către o dietă cu conținut scăzut de fibre, cu conținut scăzut de fibre a dus la modificări reversibile ale tuturor acestor parametri.

Tabel în dimensiune completă

Rezultatul

Modificări ale mucoasei colonice după o modificare a dietei

( A ) Prezentare generală a grupurilor bacteriene asemănătoare genului modificate semnificativ (FDR 1 înainte și după mese și cel puțin r |> 0, 5. Corelațiile pozitive sunt indicate prin linii verzi; corelații negative cu liniile roșii. Nodurile colorate identic indică modulele de rețea cu trei sau nodurile gri care apar mai simultan reprezintă module din mai puțin de trei grupuri simultane sau cele care nu sunt reprezentate de modul. Dimensiunea eșantionului este de 20 de afro-americani și de 17 africani (nativi) din mediul rural.

Imagine la dimensiune completă

Modificări globale ale metabolismului după o modificare a dietei

Imagine la dimensiune completă

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Asocieri globale de microbi și metaboliți

Pentru a examina acest lucru, am efectuat o analiză parțială de corelație între microbii la nivel de gen și metaboliții urinari și fecali (Fig. 4b), ajustată pentru naționalitate și dietă. Deși nu putem explica biologic toate asocierile (de exemplu, propionatul se corelează cu enterobacteriile și streptococii, despre care nu se știe că produc propionat), o caracteristică izbitoare a fost aceea că metabolitul butirat a fost asociat exclusiv cu grupurile microbiene cunoscute cu conținut de propionat. exemple sunt R. intestinalis și rel., E. rectale și rel. și C. symbiosum și rel., care sunt prezentate în rețelele de co-apariție din FIG. 3b să crească atunci când ambele părți ale populației au consumat o dietă bogată în fibre.

Dieta cu conținut scăzut de fibre și metaboliți microbieni cu conținut ridicat de grăsimi

discuţie

metode

Design de studiu

Subiecte și recrutare

Voluntarii sănătoși cu vârste și sexe, cu vârsta cuprinsă între 50 și 65 de ani, au fost selectați aleatoriu din populația afro-americană din regiunea Pittsburgh din Pennsylvania și din sud-africani nativi din regiunea rurală Kwazulu. Am colaborat cu dr. Stephen Thomas, director de studii pentru minorități la Școala de sănătate publică a Universității din Pittsburgh, pentru a recruta voluntari afro-americani sănătoși din regiunea Pittsburgh și, de asemenea, am făcut publicitate studiului cu aprobarea Comitetului nostru de revizuire instituțională din zonele publice. În Africa de Sud, voluntarii au fost recrutați prin reclame plasate în centre publice comunitare, de exemplu, oficii poștale, primării, centre civice și prin Centrul de sănătate comunitară iZulu. Compensarea corespunzătoare (conform recomandărilor studiilor minoritare și a comunității iZulu și ratificată de Universitatea din Pittsburgh și KwaZulu-Natal) pentru timp și testare a fost plătită voluntarilor pentru participare.

proiecție

Consimțământul semnat informat a fost luat de la fiecare participant. Toți voluntarii africani puteau înțelege limba engleză, dar o asistentă-traducătoare a participat la procesul de consimțământ pentru a asigura înțelegerea corectă a detaliilor procedurilor de cercetare. Screeningul a fost efectuat în Pittsburgh la Centrul de Cercetare Translațională Clinică și în Africa la ambulatoriul spitalului Ngwelezana, Empangeni, KwaZulu-Natal, Africa de Sud. A fost luată mai întâi un istoric medical detaliat. Cu africani din mediul rural, o asistentă locală bilingvă a acționat ca interpret. A fost prelevată o probă de sânge de 20 ml pentru hemoleucogramă completă, VSH, electroliți și uree, albumină, fosfatază alcalină, AST și bilirubină. Dacă rezultatele au fost normale și dacă au îndeplinit criteriile de eligibilitate, au fost invitați să participe la studiu.

Eligibilitatea subiectului

Detaliile sunt prezentate în Nota suplimentară 1. Criteriile de incluziune au fost următoarele: voluntari sănătoși, din punct de vedere GI între 40 și 65 de ani (vârsta la care se recomandă screeningul/colonoscopia cancerului de colon în această populație) și indicele de masă corporală între 18 și 35 kg m −2 (Discuție suplimentară). Criteriile de excludere au fost după cum urmează: participanții la pre-colonoscopie nu erau eligibili dacă aveau antecedente de polipoză adenomatoasă familială, cancer colorectal ereditar non-polipozic, boală inflamatorie intestinală sau cancer invaziv în termen de 5 ani înainte de înscriere (h/o polipi adenomatoși acceptabili). În plus, participanții neeligibili au fost persoane cu afecțiuni renale, hepatice sau sângerante cunoscute; intervenții chirurgicale GI anterioare care au ca rezultat tulburări ale funcției intestinale din cauza pierderii intestinului sau a anatomiei modificate sau a oricărei forme de boală cronică GI care a dus la tulburarea funcției intestinale, diaree și malabsorbție; și persoanele cu utilizare de antibiotice în ultimele 12 săptămâni (discuții suplimentare), utilizarea actuală a steroizilor sau cu diabet zaharat. Criteriile de excludere după colonoscopie au fost detectarea ulcerării nerecunoscute anterior (cu adâncime și> 0,5 cm), strictură, inflamație severă și polipi> 1 cm diametru sau cancer.

Prelevare și colonoscopie de fecale, colon și mucoase

Măsurarea biomarkerilor mucoasei

Histologie. Biopsiile mucoasei colonice au fost obținute prin colonoscopie înainte și după trecerea dietei de la trei situri diferite (ascendent, transvers și descendent) și stocate în 10% formalină tamponată. Mai târziu, probele de biopsie au fost încorporate în parafină și secțiuni de 5 mm au fost tăiate și colorate fie cu hematoxilină și eozină de rutină (H&E), fie cu pete imunohistochimice (vezi mai jos). Constatările histologice pe secțiunile colorate cu H & E au fost evaluate de un histopatolog gastroenterologic (AK) orbit, cu experiență. Măsurătorile s-au concentrat pe numărul de celule inflamatorii și eozinofile din lamina propria și numărul de limfocite intraepiteliale. Scorul secțiunii colorate cu H & E s-a făcut așa cum se arată în Tabelul suplimentar 5a. Orice descoperire patologică, cum ar fi prezența organismelor parazitare, a fost înregistrată.

imunohistochimie

Diapozitivele pentru colorarea CD3 și Ki67 au fost deparafinizate la 60 ° C timp de 2 ore. Pentru a inhiba peroxidaza endogenă, lamelele au fost pretratate folosind 3% peroxid de hidrogen/metanol la temperatura camerei (RT) timp de 10 minute, urmată de recuperarea antigenului cu soluție de pepsină 0,2% (P7012, Sigma, 3050 Spruce St, St Louis, MO, SUA) la 37 ° C timp de 10 min. Blocul de proteine ​​fără ser (X0909, Dako, 6392 Via Real, Carpinteria, CA 93013, SUA) a fost utilizat la RT timp de 10 minute. Diapozitivele au fost drenate și incubate cu anticorpii primari CD3 și Ki67 (A0452, 1: 100, policlonal de iepure, Dako; MIB-1, 1: 100, șoarece monoclonal, Dako), respectiv, la RT timp de 1 oră. Detectarea secundară a fost aplicată folosind kitul de detectare a polimerului anticorp universal Immpress (MP-7500, Vector Labs, 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010, SUA) la RT timp de 30 de minute. Diapozitivele au fost colorate cu kit de substrat DAB (SK-4100, Vector Labs) timp de 10 minute și contracolorate folosind Shandon Hematoxylin (6765015, Thermo Scientific, 81 Wyman St, Waltham, MA 02451, SUA).

Colorarea cu diapozitive pentru CD68 a fost făcută pe un colorant cu diapozitive Ventana Benchmark Ultra. Diapozitivele deparafinizate au fost pretratate folosind ultra CC1 (950-224, Ventana, 1910 Innovation Park Dr, Tucson, AZ 85755, SUA) timp de 24 de minute pentru recuperarea antigenului. Diapozitivele au fost incubate cu anticorpul primar CD68 (M087601, 1: 100, șoarece monoclonal, Clona PG-M1, Dako,) timp de 32 min RT. Kitul Optivew DAB (760-700, Ventana) a fost utilizat pentru detectarea secundară.

Cuantificarea colorării imunohistochimice

Numărarea proporțiilor de celule de colorare pozitivă utilizând microscopie cu lumină la mărirea × 400 a fost efectuată de un singur investigator (KM), în condiții de orbire. Pentru a evalua variabilitatea inter-observator, 40 de diapozitive au fost selectate aleatoriu și reluate de un al doilea patolog senior (AK), arătând o concurență de 88% pentru Ki67 + și 80% pentru densitățile CD68 +.

Proporția celulelor de colorare Ki67-pozitive a fost numărată în cripte bine orientate (medie/diapozitiv 8, interval 4-14). Rata de proliferare Ki67 a fost definită ca numărul de celule Ki67 + împărțit la numărul total de celule criptă și a fost exprimată ca procent. Diferențele s-au dovedit a fi aceleași în cripta totală și în cripta superioară; prin urmare, aici sunt raportate doar proporțiile totale ale criptei.

Numai limfocitele intraepiteliale colorate cu CD3 + au fost numărate într-o zonă reprezentativă de cel puțin 300 de celule epiteliale. Densitatea limfocitelor intraepiteliale a fost exprimată ca un indice al numărului de limfocite CD3-pozitive la 100 celule epiteliale.

Numărul de celule CD68-pozitive (macrofage) din lamina propria au fost numărate și clasificate pe o scară de la 1 la 3: gradul 1 (nici unul/rar), gradul 2 (colecții superficiale împrăștiate) și gradul 3 (puternic, difuz sau bandă) - cum ar fi infiltratul în lamina propria superficială) așa cum se arată în Fig. 1c.

Analiza țintită a microbilor fecali și colonici și a metaboliților de interes special

Aminoacizi plasmatici

Concentrațiile sanguine de post au fost măsurate în plasmă extrasă prin derivatizare precolumnă C-18 cu fază inversă HPLC (AccQ · Tag Ultra derivatizare, Waters, Milford, MA) așa cum s-a descris anterior 5 .

analize statistice

Analiza statistică a diferențelor de grup în variabilele continue a fost efectuată utilizând SPSS 16.0 (SPSS Inc.). Semnificația diferențelor de grup pentru datele distribuite în mod normal a fost evaluată cu teste t ale elevilor neimperecheate și împerecheate. Datele non-parametrice au fost analizate cu un test Mann-Whitney U-test sau Kruskal-Wallis cu o singură direcție a varianței (ANOVA) pe ranguri pentru date nepereche și teste Wilcoxon cu rang semnat pentru date asociate. Semnificația asocierii a fost evaluată cu testul de corelare a rangului Spearman. Un nivel de P 59, 60, 61, 62, deoarece permite profilarea profundă a filotipurilor la rezoluție ridicată, până la 98%) 59 și la un cost considerabil mai mic.

Analiza HITChip

Analiza rețelei de co-apariție microbiană

Analiza globală a metabolomului: pregătirea probei pentru analiza spectroscopică RMN

Toate probele urinare au fost decongelate la RT și agitate timp de 10 secunde. Un total de 400 μl de probă urinară a fost bine amestecat cu 250 μl de tampon fosfat de sodiu 0,2 M conținând 20% D20, pH 7,4, 0,01% 3- (trimetilsilil) - [2, 2, 3, 3-2H 4] sare de sodiu a acidului propionic și azidă de sodiu 3 mM (NaN 3). Amestecul a fost inițial centrifugat la 10.000 g timp de 10 min și 600 pl de supernatant au fost transferate într-un tub RMN cu un diametru exterior de 5 mm. Aproximativ 200 mg de probă de fecale umede au fost amestecate cu 600 pl de H2O (grad HPLC) într-un tub Eppendorf de 1,5 ml. Un ciclu de vortexare de 30 s, sonicare de 5 minute la 4 ° C și vortex de 30 s a fost apoi efectuat pe amestec, urmat de centrifugare la 10.000 g timp de 10 min. S-au adăugat un total de 400 pl de supernatant într-un tub Eppendorf de 1,5 ml conținând 250 pl tampon fosfat de sodiu menționat mai sus, vortexat și rotit la 10.000 g timp de 10 min. O cantitate de 600 pl de supernatant a fost introdusă într-un tub RMN.

Spectroscopie 1 H RMN

Spectrele 1 H RMN ale probelor de extract de apă urinară și fecală au fost achiziționate folosind un spectrometru Bruker 600 MHz (Bruker, Rheinstetten, Germania) la frecvența 1 H de funcționare de 600,13 MHz la o temperatură de 300 K. O secvență de impuls RMN (întârziere de reciclare - 90 ° - t 1 -90 ° - tm -90 ° achiziție) și parametrii standard au fost utilizați pentru a obține date spectrale unidimensionale 1 H RMN, așa cum este descris în Beckonert și colab. 67

Analiza datelor statistice multivariate

Generarea de rețea de reacție metabolică

Folosind software-ul gratuit MetaboNetworks, 19 reacții care apar spontan sau prin intermediul enzimelor legate de genomul uman și/sau bacterian au fost identificate în KEGG. Toate secvențele complete ale genomului enumerate în KEGG care ar putea fi asociate grupurilor bacteriene reprezentate pe HITChip au fost incluse în crearea bazei de date, rezultând un total de 817 genomi bacterieni incluși în baza de date. Apoi, software-ul a fost utilizat pentru a construi o rețea de reacție metabolică pe cea mai scurtă cale între toți metaboliții (fecali și urinari) semnificativ diferiți în oricare dintre diferitele comparații dietetice. Din această „rețea globală”, au fost generate două sub-grafice pentru fiecare dintre cele două comutatoare dietetice folosind metaboliți fecali semnificativ asociați. Pentru a evidenția expresia diferențială a metaboliților asociați cu căi specifice, umbrirea fundalului a fost adăugată graficelor pentru a indica diferitele căi de interconectare (Fig. 5a - c). Abrevierile și numele complete ale acestor metaboliți pot fi găsite în Tabelul suplimentar 11.

Informatii suplimentare

Fișiere PDF

Informatii suplimentare

Figuri suplimentare 1-6, tabele suplimentare 1-11, discuții suplimentare, metode suplimentare și referințe suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.