Cromatografia în fază normală este un termen folosit pentru a separa moleculele folosind interacțiunea grupurilor caracteristice polare hidrofile cu matricea hidrofilă a unei coloane cromatografice, faza mobilă fiind un solvent nepolar, de ex. cloroform (HC-Cl3). Această tehnică este utilizată pentru separarea analiților organici mici, dar nu este foarte potrivită pentru separarea proteinelor mari.
Pe de altă parte, cromatografia în fază inversă (RPC) folosește suprafețe hidrofobe ale unei proteine pentru a interacționa cu un ligand hidrofob. Hidrofobicitatea proteinei este reprezentată în principal de lanțurile laterale ale aminoacizilor izoleucină, valină, leucină, fenilalanină, cisteină, metionină și triptofan. Faza mobilă este un solvent extrem de polar.
| faza normală | fază inversă | |
| grup caracteristic ligandului | hidrofil | hidrofob |
| interacțiunea cu matricea | hidrofil | hidrofob |
| faza mobilă inițială | nepolar | foarte polar |
| eluare | solvent polar | solvent nepolar |
Matricea din RPC este silicagel sau un copolimer sintetic (polistiren) care poate rezista la presiuni de operare mai mari. Bilele mai mici oferă o rezoluție mai bună. Alegerea ligandului depinde de natura hidrofobă a proteinei de purificat. Matricile cu un lanț lateral hidrofob lung (de exemplu, C18) leagă proteinele foarte strâns, în timp ce lanțurile C4, resp. gruparea fenil aromatică este mai slabă în legătură, deci se leagă doar de proteinele puternic hidrofobe. În general, este bine să începeți cu o matrice cu hidrofobitate redusă.
Prin reducerea polarității fazei mobile - prin schimbarea treptată a unui solvent organic nepolar, interacțiunea regiunilor hidrofobe ale proteinelor cu matricea scade și are loc eluarea lor. Cu cât proteina este mai hidrofobă, cu atât este mai mare volumul de solvent organic care trebuie utilizat pentru eluarea acesteia. Solventul cel mai frecvent utilizat este acetonitrilul (H3C-C≡N) sau metanolul (H3C-OH).
După echilibrarea coloanei, aplicați soluția de proteină. Doar moleculele hidrofobe sunt capturate pe coloană. Prin creșterea treptată a concentrației solventului organic (0-100%), obținem o deplasare treptată a proteinelor din matrice. Cele mai puternice interacțiuni pot fi oprite numai după câțiva pași de spălare cu solvent 100%. În cele din urmă, echilibrați coloana cu o soluție cu caracter polar sau un solvent organic cu concentrație foarte scăzută.
Avantajul cromatografiei în fază inversă este posibilitatea separării unei game largi de molecule, inclusiv molecule încărcate și polare, control constant al condițiilor de separare (tip solvent, concentrație, pH, temperatură), stabilitate ridicată și eficiență și robustețe a coloanei. Această metodă este potrivită în scopuri analitice, dar nu este foarte potrivită pentru purificarea proteinelor pentru a studia proprietățile sale biologice, deoarece un solvent organic poate provoca denaturarea acesteia. Este utilizat în principal în tehnica HPLC, care separă proteinele sub presiune mai mare a fazei mobile. O alternativă la RPC este cromatografia hidrofobă (HIC).