abstract

Principalul

Comparativ cu transplantul genotipic de măduvă osoasă (BMT) identic cu HLA, grefa de donator fără legătură (URD) ​​este asociată cu o rată de mortalitate mai mare. Boala severă grefă versus gazdă (aGVHD) și eșecul grefei sunt cauzele majore ale mortalității legate de transplant (TRM) în acest cadru și pot fi legate de gradul de incompatibilitate HLA.

Standardele anterioare pentru tiparea HLA au inclus metode serologice pentru moleculele HLA-A și -B și tiparea HLA-DRB1 pe bază de ADN. Identitatea donator-destinatar HLA-DRB1 reduce riscul de aGVHD și îmbunătățește supraviețuirea după URD-BMT. -DRB1. dintre cei transplantați cu frați identici cu HLA.1 Studii recente sugerează că aceste complicații pot fi rezultatul diferențelor dintre HLA-A și -B între pacient și donator.89101112 De fapt, au fost descrise mai mult de 300 de alele la nivel molecular. 85 antigeni clasa I.13 definite serologic În plus, perechile „asociat” serologic HLA-A și -B sunt de fapt adesea nepotrivite HLA-C.141516 Cu toate acestea, implicațiile clinice ale unor astfel de nepotriviri par neclare. Într-un studiu realizat de Petersdorf și colab. Cele 10 nepotriviri HLA de clasa I s-au corelat mai mult cu eșecul grefei decât cu GVHD acut și au supraviețuit afectate numai în cazurile cu mai multe nepotriviri. În schimb, într-un studiu realizat de Sasazuki și colab., 9, chiar și o nepotrivire HLA-A sau B a afectat supraviețuirea prin creșterea GVHD acută severă. În acest studiu, nepotrivirea locusului C a fost asociată cu o rată redusă de recidivă, iar efectul neconformității de clasa I asupra rezultatului clinic părea chiar mai important decât neconformitatea de clasa II.

În plus față de tiparea moleculară, au fost dezvoltate teste bazate pe celule pentru a prezice efectul diferențelor HLA de clasa I asupra probabilității de aGVHD. Acestea constau în determinarea frecvenței precursorilor de celule T donatori citotoxici (CTLp) cu specificitate anti-receptor (direcția GVHD) .17 Frecvențele CTLp scăzute se corelează puternic cu HLA-A și -B identice.811

Deoarece utilizarea URD-BMT a crescut odată cu creșterea dimensiunii registrelor donatorilor, sunt necesare urgent mai multe date pe această temă pentru a îmbunătăți practica clinică și este necesară o evaluare retrospectivă a experienței anterioare pentru fiecare echipă clinică BMT. Scopul acestui studiu a fost de a determina efectul diferențelor HLA de clasa I și II asupra rezultatului pacientului după URD-BMT. Am refăcut HLA clasa I și II folosind tehnici de ADN de înaltă rezoluție la 69 de perechi de donatori primitori transplantați între septembrie 1988 și iunie 1998 la instituția noastră. Frecvențele CTLp au fost, de asemenea, determinate în 33 dintre aceste perechi.

Materiale și metode

Procedura BMT

Studiul a inclus 69 de proceduri URD-BMT consecutive efectuate între septembrie 1988 și iunie 1998 la Spitalul Universitar Henri-Mondor (Tabelul 1). Trei pacienți au fost transplantați de două ori. Donatorii au fost identificați prin registre europene și NMDP. Principalele caracteristici ale pacienților pre-BMT sunt rezumate în Tabelul 1. Pacienții au fost împărțiți în două grupe în funcție de starea bolii în BMT: 32 de pacienți cu LMC în prima fază cronică sau leucemie acută în prima sau a doua remisie au format grupul de risc standard . iar 37 de pacienți cu BMT mai avansată au fost în grupul cu risc crescut.

Tabel în dimensiune completă

Primele 66 de proceduri BMT au fost efectuate după condiționarea mieloablativă, incluzând iradierea totală a corpului (n = 59) sau un regim pe bază de busulfan (n = 7). Au fost efectuate trei grefe secundare folosind un alt donator după procarbazină-ciclofosfamidă și globulină antitmocitară. Profilaxia ciclosporinei combinate cu GVHD și metotrexat conform protocolului din Seattle.18 Toți pacienții au primit măduvă osoasă nemodificată. GVHD acut a fost clasificat așa cum a fost definit de Glucksberg și colab .19 și a fost tratat cu doze standard de steroizi, în caz de eșec cu doze mari de steroizi sau ATG.

Tastarea HLA și asocierea pacient-donator

Tastarea HLA înainte de BMT:

Donatorii au fost selectați pe baza tipării HLA-A și -B utilizând tehnica microlimfocitotoxicității20, care a identificat specificitățile respective recunoscute de Organizația Mondială a Sănătății (OMS) în momentul transplantului. Tipul HLA de clasa II a fost efectuat prin tehnici disponibile în momentul transplantului. Astfel, fenotipurile HLA-DR și -DQ au fost studiate la rezoluție mică în 14 perechi utilizând serologie (n = 3) sau RFLP (polimorfism de lungime a fragmentului de restricție) (n = 11), în timp ce în celelalte 55 de perechi, HLA-DRB1, Tastarea -DQB1 și -DPB1 a fost efectuată la rezoluție înaltă prin PCR-revers dot blot (Innogenetics, Bruxelles, Belgia) plus PCR-RFLP2122 pentru HLA-DRB1 și -DQB1.

Tastare HLA retrospectivă:

Tastarea HLA clasa I a fost efectuată retrospectiv folosind PCR-SSP (primer specific secvenței) (Dynal, Oslo, Norvegia).

„Semifabricatele” serologice HLA-A și HLA-B au fost re-tipizate utilizând tipizarea ADN-ului cu rezoluție mică. Toți antigenii HLA-A exprimați serologic au fost definiți la nivel alelic. Antigenele HLA-B exprimate serologic au fost definite la rezoluție înaltă în funcție de disponibilitatea kiturilor comerciale (fenotipul HLA-B a fost complet definit la rezoluție înaltă în 39 din 69 de perechi donator-primitor). Locusul HLA-C a fost studiat prin tehnica de definire a alelelor Cw1-18.

HLA-DRB1, -DQB1 și -DPB1 au fost retipate în 14 perechi donator-primitor scrise anterior la rezoluție mică.

Calculul frecvențelor CTL-p

Testele CTLp au fost efectuate așa cum este descris în Kaminski și colab. 17 Pe scurt, testele au fost efectuate în „direcția GVHD”, folosind celule donatoare ca celule care răspund și celule receptor ca celule stimulatoare. Puțurile au fost considerate pozitive dacă eliberarea lor de 51 Cr a fost mai mare decât media plus 3 deviații standard (sd) ale controlului negativ (celule stimulatoare fără celule receptive la celule). Frecvențele CTLp sub 1/300000 au fost considerate negative.8

metode statistice

Datele au fost colectate și actualizate începând cu 15 noiembrie 1998, oferind o urmărire minimă de 7 luni, maxim 122 luni și o supraviețuire mediană de 29 luni (interval 7 - 122 luni). Probabilitățile estimate de aGVHD, TRM și supraviețuire au fost calculate și reprezentate grafic prin metoda Kaplan-Meier și comparate folosind testul log-rank. Pacienții cărora li s-a efectuat al doilea transplant au fost cenzurați pentru primul transplant în ziua celui de-al doilea BMT.

Rezultatul

Frecvențe de tastare HLA și pCTL

La momentul transplantului, șase perechi donator-primitor erau cunoscute ca fiind nepotrivite pentru antigenul HLA-A sau -B (UPN 671, 588, 536, 620, 629, 643); două perechi au fost HLA-DQB1 nepotrivite (UPN 495, 547) și o pereche a fost HLA-A și -DQB nepotrivite (UPN 502) (Tabelul 2).

Tabel în dimensiune completă

Tipul retrospectiv al ADN-ului a confirmat toate discrepanțele identificate serologic. Au fost găsite alte discrepanțe la șapte din cele nouă perechi donator-primitor cunoscute fără legătură (Tabelul 2). Dintre cele 60 de perechi de alți destinatari donatori, discrepanțele HLA care nu au fost identificate în momentul transplantului au fost găsite în 27/60 (45%), în timp ce 33/60 (55%) perechi au fost confirmate ca fiind identice pentru HLA-A, -B Allele -C, -DRB1 și -DQB1. Astfel, după tastarea retrospectivă, 36/69 (52%) din perechile donator-primitor nu s-au potrivit. Dintre aceste perechi, 27 au fost nepotrivite numai cu antigene HLA clasa I, cinci perechi au fost nepotrivite doar cu antigene HLA clasa II și patru au fost nepotrivite pentru antigene HLA clasa I și clasa II.

HLA clasa I

Fenotipurile serologic goale au fost întotdeauna confirmate prin tastarea ADN-ului cu rezoluție scăzută, care a arătat, de asemenea, că un individ a fost identificat incorect prin tastarea serologică (HLA-B57 (17) în loc de HLA-B58 (17) (UPN 502)). Dintre cele 62 de perechi care au răspuns serologic la HLA-A și -B în momentul transplantului, nepotrivirile HLA-A și/sau -B au fost găsite la 13 după tastarea retrospectivă (tabelele 2 și 3). Antigenele HLA-B au fost determinate prin tastare de înaltă rezoluție în 17/33 perechi de donatori și destinatari împerecheați și 22/36 perechi nepotrivite.

Tabel în dimensiune completă

Dintre cele 69 de perechi, au existat 23 de nepotriviri HLA-C (Tabelul 3). Zece au avut o singură nepotrivire antigenă HLA-C, în timp ce 12 au avut, de asemenea, nepotriviri HLA-A și/sau -B și una a avut, de asemenea, o nepotrivire HLA clasa II (tabelele 2 și 4). Toate moleculele HLA-B au fost scrise la rezoluție înaltă în 10 perechi cu nepotrivire HLA-C. Astfel, după tiparea retrospectivă a ADN-ului, 31/69 (45%) perechi au avut cel puțin o nepotrivire HLA clasa I.

Tabel în dimensiune completă

HLA clasa II

Dintre cele 14 perechi de destinatari donatori care au fost fenotipați la rezoluție scăzută în momentul transplantului, discrepanțele de tipare retrospectivă au fost găsite la șase probabil perechi de donatori identici - beneficiari HLA clasa II; trei dintre ele erau HLA-DQB1 nepotrivite (UPN 392, 441, 380), una era HLA-DRB1 și -DQB1 nepotrivite (UPN 373), iar două erau HLA clasa I și clasa II nepotrivite (UPN 426, 306) (Tabelul 2 )). O pereche de donatori 9/69 beneficiari au fost, prin urmare, HLA clasa II neconformă.

Tastarea HLA-DPB1 a arătat că doar nouă perechi pacient-donator au fost împerecheate în acest sens. În total, doar cinci perechi de HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 și -DPB1 au fost identice.

Haplotipuri ancestrale

Pentru a determina dacă este posibil să se prezică frecvența nepotrivirii detectate prin tiparea ADN-ului de înaltă rezoluție pe baza haplotipurilor conservate, am clasificat fenotipurile HLA ale perechilor donator-receptor identificate în momentul transplantului pe baza prezenței probabile a unuia sau a două dintre 25 de strămoși definiți de Christiansen și colab. regulament). Două perechi pot avea două AH, 29 una AH și 30 fără AH. Dintre cele 122 de haplotipuri analizate, nepotrivirile HLA de clasa I au fost mai frecvente după ADN-ul de înaltă rezoluție în cadrul haplotipurilor care au fost considerate nenăscute decât în ​​AH (21/89 vs 2/33) (P = 0,017 testul exact al lui Fisher).

Frecvențele CTLp au fost determinate pentru 33 de perechi. După tastarea ADN-ului, 14 perechi de HLA clasa I au fost nepotrivite în direcția GVHD și 19 perechi au fost împerecheate (Tabelul 5). Dintre cele 14 perechi care nu se potriveau, s-a găsit o frecvență ridicată a CTLp în nouă perechi și frecvențe joase în cinci perechi. Dintre aceste ultime cinci perechi, două erau nepotriviri HLA-A (UPN 671, 547), una era o nepotrivire HLA-B (UPN 642) și două erau nepotriviri HLA-C (UPN 680, 668). Frecvențe scăzute CTLp au fost găsite în 19 perechi în direcția GVHD.

Tabel în dimensiune completă

a prinde

Șase pacienți au murit înainte de ziua 30 după transplant, indicând că 63 de grefe ar putea fi evaluate. Eșecul grefei a avut loc în cinci cazuri. Patru din cele cinci perechi au fost HLA clasa I nepotrivite în direcția HVG (gazdă versus grefă) (UPN 526, 436, 617, 536) și una a fost identică. Doi pacienți au avut o nepotrivire antigenă HLA-C (UPN 617, 436), unul a avut o nepotrivire antigenă HLA-B (UPN 526), ​​iar unul a avut o nepotrivire HLA-B și -C (UPN 536).

AGVHD, TRM și supraviețuire

Nouăsprezece din 66 de pacienți trăiesc (mediană 28 de luni, intervalul 7-122 luni după BMT), inclusiv pacienții cu reconstituire autologă (UPN 617) și pacienții cu recidivă de limfom (UPN 600). Rata de supraviețuire globală pentru întreaga cohortă este de 28 ± 6%, iar valorile sunt corelate cu starea hematologică (55% față de 9%) (P

înaltă

Estimările supraviețuirii Kaplan-Meier pentru pacienții cu „stare de risc standard” (linie continuă) comparativ cu pacienții cu „stare de risc ridicat” (linie punctată). Probabilitatea de supraviețuire a fost de 55% pentru pacienții cu risc standard și de 9% pentru pacienții cu risc crescut (P

Estimările supraviețuirii Kaplan-Meier la pacienții cărora li s-au efectuat transplanturi HLA clasa I și II (linie continuă) comparativ cu cei care au primit transplanturi HLA clasa I și/sau II (linie punctată). Probabilitatea de supraviețuire a fost de 40% la pacienții care au răspuns și de 20% la pacienții care nu au răspuns (P

Probabilitatea de aGVHD de gradul III-IV în transplanturile HLA (linie continuă) și neconforme HLA (linia punctată). Dintre pacienții care ar putea fi evaluați pentru GVHD, 2/30 pacienți potriviți și 16/33 pacienți fără potrivire au dezvoltat aGVHD sever (P

Estimările supraviețuirii Kaplan-Meier la pacienții care au primit transplanturi HLA de clasa I și II potrivite (linie continuă) comparativ cu cei care au suferit transplanturi de clasă I HLA care nu se potrivesc (linie punctată). Probabilitatea de supraviețuire a fost de 42% pentru transplanturile corespunzătoare claselor HLA I și II și de 18% pentru transplanturile corespunzătoare nepotrivirilor HLA clasa I și clasa II (P

Comparația estimărilor de supraviețuire Kaplan-Meier în patru subgrupuri: „starea standard a riscului” și transplanturile corespunzătoare; „Starea standard de risc” și transplanturile neconforme; „Stare cu risc ridicat” și transplanturi corespunzătoare; Transplanturi „cu risc ridicat” și incoerente. Probabilitatea de supraviețuire a fost de 66%, 31%, 9% și 8%.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Studiul nostru confirmă în mod clar că supraviețuirea după URD-BMT ar putea fi îmbunătățită prin potrivirea donator-beneficiar pentru HLA-A, -B, -C la un nivel ridicat de rezoluție, sugerând că incompatibilitatea HLA a fost detectată numai prin tastarea cu rezoluție înaltă (adică lipsă) tehnici convenționale) sunt relevante din punct de vedere clinic. Deși acest lucru este cunoscut pentru împerecherea HLA clasa II de câțiva ani, aceasta a fost determinată doar pentru clasa HLA I prin două studii recente.910 Studiul nostru arată o frecvență ridicată a nepotrivirii HLA clasa I între donatorul serologic HLA-A și -B -perechi de destinatari. Într-adevăr, nepotrivirile alelice HLA-A și/sau -B au fost găsite în 13/62 (21%) perechi serologice și în 6/7 (86%) perechi cunoscute a fi nepotrivite în momentul transplantului. În plus, acest studiu evidențiază frecvența ridicată a nepotrivirii HLA-C (23/69, 33%), care a apărut în 11/23 cazuri fără nepotrivire HLA-A și/sau -B.

Interesant este că analiza noastră sugerează că AHs sunt mai rar asociate cu disparitățile alelice HLA clasa I, în concordanță cu studiul lui Prasad și colab. 12 Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că segregarea AH se bazează pe un calcul de probabilitate și nu poate fi determinată. studii de familie donatoare.

Recent, testele CTLp au fost introduse în multe unități de transplant pentru a detecta nepotrivirile HLA de clasa I lipsă sau pentru a prezice aGVHD.8 La centrul nostru, rezultatele CTLp au fost utilizate pentru a selecta donatorii pre-transplant și au fost eliminați donatorii cu cele mai mari teste CTLp. În acest studiu, atunci când se compară CTLp și tiparea ADN, testele CTLp ridicate au fost întotdeauna asociate cu nepotrivirea HLA clasa I. Cu toate acestea, testele CTLp negative au fost observate în cinci perechi, în ciuda nepotrivirii GVHD (inclusiv trei cazuri de nepotrivire HLA-A sau - B), ceea ce este în concordanță cu studiul realizat de Scott și colab. 11 CTLp poate fi util pentru detectarea nepotrivirilor permisive HLA clasa I. \ T Cu toate acestea, apariția aGVHD severă la doi din patru pacienți cu doar nepotriviri HLA clasa I și teste CTLp negative nu ne permite să confirmăm această posibilitate.

Recent, două studii au arătat o corelație între conformitatea HLA clasa I și rezultatul clinic.910 Sasazuki și colab 9 au găsit o corelație între nepotrivirea HLA-A, -B și -C și o incidență ridicată a aGVHD severă, în timp ce nepotrivirea clasei I a fost asociată cu Petersdorf și colab., 10, în special pentru locusul HLA-C.24 Pe de altă parte, Sasazuki și colab. au constatat că asocierea HLA-C este corelată cu riscul de recurență a leucemiei 21, care poate fi explicat prin inhibarea activității celulelor NK în cazurile de identitate HLA-C între donator și Diferitele rezultate dintre cele două studii pot fi explicate prin diferențe de fond etnic și boală hematologică (pacienți cu LMC comparativ cu registrul național). În studiul nostru, a fost observată o mortalitate ridicată legată de transplant la pacienții cu nepotrivire HLA de clasa I din cauza unei incidențe ridicate de aGVHD sever. În plus, au fost observate 4/5 cazuri de eșec al grefei la acest grup de pacienți. Astfel, nepotrivirea HLA-C poate fi asociată cu aGVHD severă, precum și cu eșecul grefei, confirmând rolul HLA-C ca antigen de transplant. Influența identității HLA-C asupra recurenței leucemiei nu a putut fi analizată în lucrarea noastră, din cauza numărului redus de perechi donator-beneficiar.

În concluzie, tiparea genomică a alelelor HLA clasa I și II contribuie semnificativ la succesul transplantului de la donatori independenți, supraviețuirea mediană din același grup fiind comparabilă cu supraviețuirea în transplant cu frați identici cu genele. Prognosticul slab al pacienților care au suferit un transplant non-HLA sugerează necesitatea unor noi metode de transplant.