abstract

Mai multe gene ale tirozin kinazei sunt implicate în translocațiile cromozomiale în tulburările mieloproliferative cronice, dar în unele cazuri există încă translocații nestandardizate. Raportăm două astfel de cazuri corespunzătoare leucemiei mieloide cronice atipice cu translocație (8; 9) (p22; p24). Prin fluorescență hibridizare in situ (FISH) pe metafazele corespunzătoare cu o sondă cromozomică artificială bacteriană cuprinzând gena janus kinase 2 (JAK2) la 9p24, am observat o distribuție la ambii pacienți, indicând faptul că această genă a fost rearanjată. Locusul 8p22 conține diferite gene candidate, inclusiv gena materialului pericentriolar 1 (PCM1), care este deja implicată în translocații reciproce. Rearanjarea genei PCM1 a fost demonstrată de FISH la ambii pacienți. RT-PCR a confirmat fuziunea părții 3 'a JAK2 cu partea 5' a PCM1. Analiza secvenței a ARNm himeric PCM1-JAK2 indică faptul că proteina putativă are domenii de bobină PCM1 și domenii de tirozin kinază JAK2. Această nouă translocație identifică JAK2 ca o țintă terapeutică potențială pentru compușii cu activitate antitirozin kinazică.

Principalul

Dintre tulburările mieloproliferative cronice, leucemia mieloidă cronică este o paradigmă, deoarece este asociată cu o translocație reciprocă care implică gena Abelson tirozin kinazei (ABL) (Heisterkamp și colab., 1983). Translocarea t (9; 22) (q34; q11) produce o proteină de fuziune BCR-ABL cu activitate de tirozin kinază care poate fi blocată de un compus mic, mesilat de imatinib (STI571) (Druker și colab., 2001). La unii pacienți cu caracteristici clinice ale LMC (LMC atipică), sunt incluse alte gene care codifică tirozin kinaze, precum PDGFRA (Baxter și colab., 2002; Trempat și colab., 2003) și PDGFRB (Baxter și colab., 2003).

În acest studiu, raportăm două cazuri de LMC atipică cu aceeași translocație t (8; 9) (p22; p24). Una dintre genele candidate implicate în această nouă translocație este foarte probabil să aparțină grupului de gene care codifică proteinele cu activitate de tirozin kinază. Gena janus kinaza 2 (JAK2) este un candidat bun, deoarece se află la 9p24. De fapt, JAK2 a fost descris în mai multe cazuri de T-ALL (Lacronique și colab., 1997), B-ALL și CML atipic (Peeters și colab., 1997), în care este fuzionat cu TEL/ETV6. În plus, mai multe grupuri (Baxter și colab., 2005; James și colab., 2005; Levine și colab., 2005) au raportat că singura mutație activată dobândită JAK2 (Val617Phe) a fost observată la majoritatea pacienților cu policitemie vera, trombocitemie esențială și mielofibroză idiopatică.evidențiind rolul acestei kinaze în bolile mieloproliferative.

Examinările pe care le-am efectuat s-au bazat pe presupunerea că gena JAK2 a fost rearanjată în celulele tumorale ale a doi pacienți. Ne-au permis să caracterizăm o nouă translocație reciprocă cu fuziune PCM1 la 8p22 cu JAK2 la 9p24.

Pacientul 1, un bărbat în vârstă de 46 de ani, a fost internat în ianuarie 1998 pentru astenie, scădere în greutate și anomalii ale sângelui. La examinarea fizică, pacientul a prezentat pielea palidă, dar nu a prezentat semne de mărire a ficatului sau splinei. Rezultatele de laborator au arătat anemie (hemoglobină = 11,9 g/dl), hiperleucocitoză (globulară = 11,8 × 10 9/l) și trombocite normale. Numărul de leucocite a arătat 28% granulocite imature, 2% eritroblasti, dar fără hipereozinofilie. Frotiurile măduvei osoase și biopsia trefinului au confirmat hiperplazia măduvei osoase cu mielofibroză, dar fără mielodisplazie. Analiza cromozomială a celulelor măduvei osoase a arătat o translocație izolată t (8; 9) (p22; p24) fără cromozomul Philadelphia. Diagnosticul final a fost LMC atipic. Pacientul a fost tratat cu Hydrea și a primit un transplant alogen de măduvă osoasă în august 1998. S-a recuperat după hematopoieză după o lună, dar a murit în ianuarie 1999 de pneumonie infecțioasă asociată cu sindromul hemofagocitar.

Pacientul 2, un bărbat în vârstă de 44 de ani, a fost internat în spital în noiembrie 2004, după o istorie de 1 lună de masă supra claviculară dreaptă, cu paralizie a brațului și anestezie a bărbiei (nervului V-cranian). În acel moment, numărul de celule sanguine a prezentat hiperleucocitoză (WBC = 45, 8 × 10 9/l) cu 21% eozinofile, 30% granulocite imature, 4% explozii și 1% eritroblaste. Aspirația măduvei osoase a fost hipercelulară și a expus 54% din mieloblastele peroxidaz-pozitive și 24% din eozinofile. Nu s-au observat semne de mielodisplazie. A fost pus un diagnostic de LMA M2 cu eozinofilie dezvoltat în cadrul LMC atipică. Analiza cromozomială a relevat un cariotip anormal cu o translocație izolată t (8; 9) (p22; p24). Pacientul a fost tratat cu chimioterapie combinată, inclusiv Idarubicin și Aracytin, asociate cu profilaxia meningeală. A obținut remisiunea completă după o lună. Tratamentul a fost încheiat prin radioterapie până la un solid diagnosticat la intrare.

Au fost testate diferite sonde FISH specifice pentru ABL și FGFR1 (8p11) și au confirmat lipsa rearanjării acestor gene în două cazuri (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, am căutat prezența genelor candidate pentru 8p22 și 9p24. Examinarea mai multor gene raportate pentru 9p24 a indicat cu tărie că a fost implicată JAK2 care codifică o tirozin kinază. În plus, JAK2 a fost descris în (9; 12) (p24; p13) în mai multe cazuri de leucemie limfoblastică acută și tulburări mieloproliferative cronice (Lacronique și colab., 1997; Peeters și colab., 1997). Din aceste motive, am testat cromozomii metafazici folosind FISH cu sonda corespunzătoare JAK2 BAC (RP11-927H16) marcată cu translație de nick prin biotină, așa cum s-a descris anterior (Trempat și colab., 2003). În ambele cazuri, a fost înregistrat un semnal divizat: o parte pe cromozomul 9p24 și cealaltă parte pe 8p22 (Figura 1, 1a).

leucemia

Analiza FISH: Hibridizarea in situ a fluorescenței cu sonda JAK2 (BAC RP11-927H16) și sonda PCM1 marcată cu biotină și digoxigenină (BAC RP11-484L21), respectiv, utilizând un kit de traducere nick (Amersham pharmacia biotech) conform instrucțiunilor producătorului. Pacientul 1: (1a) FISH cu sonda JAK2 (Baxter și colab.), Semnalul este împărțit între cromozomii derivați 9 și 8 (săgeți). (1b) FISH cu sondele JAK2 (verde) și PCM1 (roșu), aceste două semnale sunt împărțite (săgeți: semnale de fuziune pe cromozomii derivați 8 și 9). Pacientul 2: metafază (2a) și FISH corespunzător (2b) cu sondele JAK2 (verde) și PCM1 (roșu), aceste două semnale sunt împărțite (săgeți: semnale de fuziune). Celelalte semnale corespund cromozomilor netranslocați 8 și 9. JAK2 și PCM1 sunt rearanjate în aceste două cazuri.

Imagine la dimensiune completă

Privind la locusul 8p22, cel mai bun candidat sa dovedit a fi gena materialului pericentriolar 1 (PCM1), care fusese descrisă anterior într-o translocație reciprocă generând o genă de fuziune cu RET la 10q11 (Corvi și colab., 2000). Prin urmare, am proiectat seturi de grund în cadrul secvențelor de codare 3 'ale JAK2 (corespunzătoare domeniului TK) și în regiunea de codare 5' a PCM1 și am generat o analiză RT-PCR a ARN-ului total din celulele tumorale ale ambilor pacienți. Produsul de 4 kb a fost obținut cu ARN pacient 1 (Figura 2). După secvențiere, acest produs a corespuns putativului ARNm de 9401 bp. Structura cadrului de citire deschisă a transcrierii himerice PCM1-JAK2 a arătat că exonul 37 PCM1 (NM_006197) se afla în cadru cu exonul 9 JAK2 (NM_004972). Această structură demonstrează conservarea tuturor domeniilor înfășurate în spirală ale PCM1 și a domeniului tirozin kinazei din JAK2 (Figura 3). Transcriptul invers JAK2-PCM1 a fost detectabil de către primerii corespunzători (Figura 2). Un produs PCR de aproximativ 700 bp a fost obținut dintr-o fuziune în cadru de 2363 bp. Datorită degradării semnificative a ARN-ului, RT-PCR la pacientul 2 a rămas fără succes. Cu toate acestea, fuziunea PCM1 cu JAK2 a fost confirmată de FISH la ambii pacienți (Figurile 1b, 2a, b).

Analiza RT-PCR a transcrierii himerice PCM1-JAK2: ARN-ul total a fost extras prin metoda Trizol (Gibco-BRL) și transcris invers utilizând kitul de amplificare Marathon cDNA (BD Biosciences). PCR a fost efectuată cu un sistem enzimatic BD de preferință cu 2 PCR (BD Biosciences) conform instrucțiunilor producătorului. Produsul de 4 kbp și produsul PCR de 700 bp au fost obținute cu primerii PcmF/JakK și JakC/PcmO (vezi secvențele de mai jos). Fiecare reacție PCR a fost efectuată cu un martor corespunzător unui amestec de PCR fără ADNc de intrare. Golul prezentat în figură corespunde controlului negativ al reacției PCM1-JAK2 PCR. Produsele PCR au fost purificate folosind kitul de purificare QIAquick PCR (Qiagen). Grundul intern JakF a fost utilizat pentru a secvența punctul de întrerupere între PCM1 și JAK2 folosind kitul ABI Prism Dye Terminator (Perkin-Elmer Applied Biosystem). PcmF IndexTerm 5′-TACAGCTGTCAGCTGCTAGTGTGGG-3 ′; PcmO IndexTerm 5′-TGGGCTCCCACCGTTTCACCTTCTT-3 ′; JakK IndexTerm 5′-CATCTGGGCATCCATCTGGTCTTGG-3 ′; JakF IndexTerm 5′-CTCGTCTCCACAGACACATACTCCAT-3 ′; JakC IndexTerm 5′-ACTGGAAACGGTGGAATTCAGTGGTC-3 ′

Imagine la dimensiune completă

Secvența noii transcrieri de fuziune:( A ) Cadru de citire deschis al genei himerice PCM1-JAK2. ( b ) Structura ARNm PCM1, PCM1-JAK2 și JAK2. CCD, domeniul bobinelor înfășurate; JH2, omologie JAK/domeniul pseudokinazei JAK2; PTK, proteină tirozin kinază

Imagine la dimensiune completă

În studiul nostru, gena partenerului JAK2 este PCM1, care codifică o proteină de 228 kD conținând mai multe domenii potențiale în bobină în porțiunea sa amino-terminală (Balczon și colab., 1994). Această proteină este localizată în granule citoplasmatice numite sateliți centriolari. Experimentele care vizează blocarea activității PCM1 fie cu anticorpi anti-PCM1, fie cu ARN-uri mici care interferează conduc la asamblarea dezordonată a proteinelor centrosomale și la organizarea microtubulilor, sugerând că PCM1 joacă un rol cheie în aceste procese (Dammermann și colab., 2004), în special în ciclul celular. progresie (Balczon și colab., 2002). Gena PCM1 corespunde unei regiuni cromozomiale care se pierde adesea în forme de cancer (Emi și colab., 1992; Bhattacharya și colab., 2003), dar rolul său în translocația t (8; 10) (p22; q11) în papila esofagiană tiroidiană cancerul ne-a atras atenția asupra posibilelor sale implicații asupra proteinelor himerice precum PCM1-RET. În plus, în ultimul caz, partenerul său este un receptor cu activitate de tirozin kinază (Corvi și colab., 2000).

Deoarece există o expresie relativ omniprezentă a PCM1, este probabil ca promotorul PCM1 să reprime expresia genei de fuziune PCM1-JAK2, în care capătul carboxil corespunde activității catalitice a JAK2. Datorită prezenței domeniilor multi-legare în porțiunea amino-terminală a PCM1, este posibil ca himera PCM1-JAK2 să fie supusă oligomerizării, ducând la activarea domeniului tirozin kinazei JAK2. Sunt necesare mai multe experimente in vitro pentru a confirma că căile JAK/STAT și PI3'-kinază/AKT sunt activate constitutiv ca răspuns la autofosforilarea PCM1-JAK2.

Aici, am descris două cazuri ale unei noi variante de translocație care implică genele PCM1 și JAK2. Identificarea acestor două gene partenere ar contribui la caracterizarea în continuare a noilor cazuri de tulburări mieloproliferative cu o astfel de translocație și la monitorizarea bolii reziduale după tratament. Prezentarea clinică a pacienților noștri a fost ușor diferită, dar ambii au avut un fundal în LMC atipică. Cu toate acestea, un pacient a fost diagnosticat în faza cronică fără hipereozinofilie, în timp ce celălalt a fost examinat în faza acută (celule circulante ale măduvei osoase circulante cu criză de explozie și hipereozinofilie).

Într-o perspectivă mai promițătoare, se poate presupune că JAK2 va fi o țintă bună pentru noii compuși cu activitate antitirozin kinazică.

Mulțumiri

Mulțumim dr. Storlazzi, Universitatea din Milano, și dr. Max Chaffanet, INSERM U119, Marsilia, pentru darul generos al BAC JAK2 (RP11-927H16) și, respectiv, PCM1 (RP11-484L21). Mulțumiri speciale Dr. Fabienne Meggetto și Jean-Pierre Jaffrezou, INSERM U563 CPTP, Toulouse, Franța, pentru lectura critică a manuscrisului.

Subvenții: Cancéropole Grand Sud Ouest, Ligue contre le Cancer, Comités du Gers et de la Haute Garonne