abstract

În eucariote, multe gene sunt supuse unei îmbinări alternative și codifică mai multe izoforme conducând la exprimarea proteinelor înrudite cu proprietăți biochimice și biologice diferite (Andreadis și colab., 1987). IG20 (Insulinom - Glucagonoma) este o astfel de genă care poate codifica cel puțin patru variante diferite de îmbinare (SV), și anume IG20pa (adică IG20 proapoptotic), MADD/DENN, IG20-SV2 și DENN-SV (Goto și colab., 1992, Chow și Lee, 1996, 1998; Cunningham, 1996; Schievella și colab., 1997; Al-Zoubi și colab., 2001). Aceste patru IG20 -SV diferă prin îmbinarea diferențială a exonilor 13L și 16. În raport cu IG20pa, MADD, IG20-SV2 și DENN-SV nu exprimă exonul 16 sau 13L sau ambele (Al-Zoubi și colab., 2001).

Gena IG20 joacă un rol important în proliferarea, apoptoza și supraviețuirea celulelor canceroase (Chow și Lee, 1996, 1998; Schievella și colab., 1997; Brinkman și colab., 1999; Murakami-Mori și colab., 1999; Telliez și colab. al., 2000, Al-Zoubi și colab., 2001; Lim și Chow, 2002; Efimova și colab., 2003, 2004; Lim și colab., 2004; Ramaswamy și colab., 2004). În plus, joacă un rol important în neurotransmisie (Zhang și colab., 1998; Tanaka și colab., 2001; Yamaguchi și colab., 2002), neurodegenerare (Del Villar și Miller, 2004) și schimbul de nucleotide de guanină (Wada și colab. 1997, Brown și Howe, 1998; Iwasaki și Toyonaga, 2000; Levivier și colab., 2001). Aceste funcții divergente sunt cel mai probabil mediate de splicing alternativ (Chow și colab., 1998; Al-Zoubi și colab., 2001; Efimova și colab., 2004).

Nivelurile de expresie a genei IG20 sunt mai mari în celulele și țesuturile canceroase în comparație cu omologii lor normali. Deși MADD și DENN-SV sunt exprimate în mod constitutiv (DENN-SV este supraexprimat comparativ cu alte SV în cancer), expresia IG20pa și IG20-SV2 este reglementată prin faptul că acestea pot sau nu să fie exprimate în anumite celule. Acest lucru indică faptul că IG20pa și IG20-SV2 nu sunt necesare pentru supraviețuirea celulei (Efimova și colab., 2004).

Am efectuat anterior studii pentru a îmbunătăți funcția prin exprimarea IG20-SV individuale în celulele HeLa și am arătat că variantele MADD și IG20-SV2 au un efect redus sau deloc asupra proliferării celulare și apoptozei induse. În timp ce IG20pa crește sensibilitatea atât la stimuli apoptotici externi, cât și interni și suprimă proliferarea celulară, DENN-SV a oferit rezistență la apoptoză indusă și proliferare crescută a celulelor. Astfel, IG20pa și DENN-SV au acționat ca un „supresor tumoral” și un „oncogen” (Efimova și colab., 2004).

Knockdown-ul tuturor IG20-SV endogene folosind oligonucleotide antisens a dus la apoptoza spontană a celulelor canceroase in vitro și in vivo (Lim și Chow, 2002; Lim și colab., 2004). Astfel, efectele contrastante ale IG20-SVs menționate mai sus pot fi elucidate doar prin excluderea IG20-SV individuale și determinarea efectelor ulterioare. Acest lucru a ridicat mai multe provocări, deoarece IG20-SV diferea doar în expresia diferențială a exonilor 13L (130 bp) și 16 (60 bp) (Al-Zoubi și colab., 2001). Cu toate acestea, folosind ARN-uri cu ac de păr mici (shRNA) care vizează în mod specific exonii 13L, 15 și 16, am reușit să precipităm selectiv toate combinațiile diferite sau diferite de IG20-SV în liniile celulare canceroase HeLa și PA-1 și să determinăm rolul lor în supraviețuire celule. Rezultatele noastre arată că MADD singur este necesar și suficient pentru supraviețuirea acestor celule canceroase.

Rezultatul

ARN-urile inhibitoare mici pot reduce selectiv expresia IG20-SV exogenă

Pentru a determina IG20-SV, care contribuie la apoptoză și proliferarea celulară, am folosit ARN-uri inhibitorii mici (siRNA) pentru a reduce selectiv IG20-SV (Tabelul 1) (McManus și Sharp, 2002; Cullen, 2004; Hall, 2004). SiARN-urile au fost donate în vectorul pSUPER (Brummelkamp și colab., 2002) pentru a permite expresia shARN. Celulele 293T au fost transfectate fie cu YFP-IG20pa, YFP-MADD sau YFP-DENN-SV, împreună cu diferiți vectori pSUPER care exprimă shRNA la 1: 1, 1: 3 și 1: 7. Reducerea expresiei YFP a arătat o reducere a proteinei relevante expresie. Au fost selectate mai multe shARN-uri și rezultatele pentru cele mai eficiente sunt prezentate în Figura 1a. 13L-shRNA care vizează exonul 13L downmodulat de IG20pa/MADD, lăsând expresia DENN-SV neschimbată. În schimb, 16E-shRNA a vizat exonul 16, downmodulat de IG20pa, dar nu MADD/DENN-SV. Mid-shRNA care vizează exonul 15 a modificat în jos toate testate IG20-SV. Vectorul singur sau shRNA de control au avut un efect redus sau deloc asupra expresiei IG20-SV.

Tabel în dimensiune completă

îmbinare

Screening-ul shRNA-urilor pentru eliminarea IG20. A ) Scăderea expresiei IG20-SV exogene. Celulele 293T au fost placate în plăci cu 12 godeuri și co-transfectate cu constructele IG20-SV-YFP și pSUPER-shRNA indicate. Expresia YFP este exprimată ca intensitate medie a fluorescenței. Datele prezentate (media ± SD a triplicaților) sunt reprezentative pentru trei experimente independente, fiecare cu valori P.

Modularea descendentă a IG20-SV endogen în celulele HeLa. Pentru reacția în lanț a transcripției inverse-polimerază a fost utilizată o microgramă de ARN total obținut din celulele HeLa la 72 de ore după transducție. Produsele au fost separate pe un gel de agaroză 2%. ( A ) Amplificarea tuturor celor patru IG20-SV folosind primerii F2-B2. ( b ) Cuantificarea intensităților relative ale benzii de pe panou și folosind un Alpha Imager (Alpha Innotech Corporation, CA, SUA). ( c ) Amplificarea IG20pa și MADD folosind primerii 13L-Forward și B2-Reverse. d ) Cuantificarea intensităților relative ale benzii de la panoul c.

Imagine la dimensiune completă

Modularea descendentă a IG20-SV în celulele HeLa duce la apoptoză spontană

Moartea spontană a celulelor a fost determinată de condensarea nucleară (Hoechst 33342) (Figura 3a și b) și pierderea potențialului membranei mitocondriale (colorarea esterului Tetramethylrhodamine [TMRM]) (Figura 3c și d). Modularea în jos a tuturor IG20-SVs cu Mid-shRNA a dus la apoptoză spontană semnificativă. Deși downmodularea IG20pa/IG20-SV2 nu a avut niciun efect, abolirea MADD/IG20pa a dus la creșterea apoptozei spontane. Pentru a determina dacă cauza de bază a apoptozei spontane a fost similară cu cea observată în timpul apoptozei indusă fie de calea extrinsecă (caspază-8), fie de cea intrinsecă (caspază-9), am determinat procentul de celule care exprimă caspaze active-8 și -9. prin citometrie în flux.

Efectul modificării descendente IG20-SV în celulele HeLa. ( A ) Colorare Hoechst - 72 ore după transducție, celulele HeLa au fost recoltate și colorate cu 5 ug/ml Hoechst și supuse analizei de sortare a celulelor activate cu fluorescență (FACS). Procentele de celule extrem de pozitive (celule apoptotice) sunt prezentate pe histograme. ( b ) Rezumatul rezultatelor care arată procentul de celule cu condensare nucleară crescută, măsurat prin colorarea Hoechst din trei experimente independente. Valoarea lui P a fost

Activare Caspase după downmodularea IG20-SV. ( A ) Activare generală a caspazei - celulele HeLa au fost recoltate la 60 de ore după transducție și colorate pentru toate caspazele activate folosind Red-z-VAD-FMK; ( b ) pentru caspase-8 cu Red-IETD-FMK; A ( c ) pentru caspaza-9 cu Red-LEHD-FMK și analizată de FACS. Este prezentat procentul de activare a caspazei în celulele GFP pozitive (medie ± SD a triplicaților).

Imagine la dimensiune completă

Modularea descendentă a IG20-SV nu are niciun efect aparent asupra proliferării celulelor HeLa

Pentru a evalua efectele asupra creșterii și proliferării celulare, au fost numărate diferite celule viabile care exprimă shRNA. Comparativ cu martorii, s-a observat o scădere semnificativă a numărului de celule viabile care exprimă shRNA Mid și 13L (Figura 5a). Diferența insuficientă în diluarea CFSE (acid carboxilic SNARF-1, acetat, ester succinimidil) în timp între celulele martor tratate cu celule Mid-și 13L-shRNA sugerează că diferențele în numărul de celule nu au fost datorate proliferării reduse (Figura 5b). prin placarea aceluiași număr de celule HeLa care exprimă shARN diferiți și determinarea numărului și mărimii coloniilor după 12 zile. Deși în mod semnificativ mai puține colonii s-au format din celule care exprimă Mid și 13L-shRNA (panouri d, e), dimensiunea coloniilor a fost comparabilă cu dimensiunea grupurilor de control. Mai mult, celulele tratate cu shRNA nu au prezentat diferențe semnificative în progresia ciclului celular (nu sunt prezentate). Luate împreună, aceste rezultate au arătat că ablația MADD duce în primul rând la apoptoză spontană.

Efectul downmodulării IG20 asupra proliferării celulelor Hela. A ) Creșterea celulelor. La douăzeci și patru de ore după transducție, celulele HeLa au fost placate așa cum este descris în Materiale și metode. Celulele au fost apoi recoltate și celulele viabile (celule negre de tripan albastru) au fost numărate în zilele indicate. Datele sunt media ± SD a triplicatelor. ( b ) Proliferarea celulelor. La douăzeci și patru de ore după transducție, celulele HeLa au fost colorate cu CFSE-roșu (acid SNARF-1-carboxilic, acetat, succinimidil ester), recoltate în zilele indicate și evaluate pentru diluarea CFSE prin sortare a celulelor activate de fluorescență. Numerele de pe histograme arată intensitatea medie de colorare a vârfului CFSE geometric în celulele transduse. ( c - g ) Supraviețuirea celulelor. Prezintă colorarea celulelor care au supraviețuit la 12 zile după modularea descendentă IG20 -SV în cristal purpuriu.

Imagine la dimensiune completă

Reducerea MADD în celulele carcinomului ovarian PA-1 duce la apoptoză spontană

În celulele HeLa, am putea fie downmodula toate cele patru, fie o combinație de IG20pa/MADD sau IG20pa/IG20-SV2. Pentru a demonstra în continuare că MADD este necesar pentru supraviețuirea celulelor, am folosit celule de carcinom ovarian PA-1, care exprimă în esență doar MADD și DENN-SV (Efimova și colab., 2004), permițând astfel downmodularea exclusivă a MADD de 13L-shRNA. În timp ce Mid-shRNA modulat în jos MADD/DENN-SV, 13L-shRNA a abolit doar expresia MADD (Figura 6a și b). Apoptoza spontană a fost evidentă în aproximativ 50% din celule la 72 de ore după transducție cu 13L-shRNA (Figura 6c și d).

Efectul downmodulării IG20 în celulele PA-1. ( A ) Modularea descendentă a IG20 endogen în celulele PA-1. Reacție în lanț cu transcripție inversă-polimerază a IG20-SVs din celule PA-1, la 72 de ore după transducție, folosind primerii F2-B2. ( b ) Amplificarea IG20pa și MADD numai folosind primerii 13L-F și B2. c ) Condensarea nucleară. La șaptezeci și două de ore după transducție, celulele PA-1 au fost colorate cu colorant Hoechst și analizate prin sortare a celulelor activate cu fluorescență (FACS). Procentele de celule apoptotice sunt prezentate pe histograme. ( d ) Depolarizarea mitocondrială. La șaptezeci și două de ore după transducție, celulele PA-1 au fost colorate cu TMRM și analizate prin FACS. Datele prezentate sunt reprezentative pentru trei experimente diferite.

Imagine la dimensiune completă

Am determinat capacitatea celulelor PA-1 tratate în mod similar de a prolifera. Un număr egal de celule PA-1 care au primit diferite tratamente (24 de ore după transducție) au fost cultivate și numărul de celule viabile a fost determinat în diferite momente de timp (Figura 7a). Deși pierderea MADD a dus la o scădere semnificativă a numărului de celule, similar cu celulele HeLa, nu a avut niciun efect asupra diluției CFSE sau a dimensiunii coloniilor (Figura 7b-g).

Efectul downmodulării IG20 asupra proliferării celulelor PA-1:( A ) creșterea celulelor, ( b ) proliferare, ( c ) supraviețuirea celulelor. Experimentele au fost realizate așa cum s-a descris mai sus cu celule HeLa (vezi legenda Figura 5). Datele prezentate sunt reprezentative pentru trei experimente diferite.

Imagine la dimensiune completă

MADD, nu DENN-SV, poate preveni apoptoza spontană

Knockdown-ul MADD singur în celulele PA-1 a dus la apoptoză spontană. Pentru a determina dacă expresia DENN-SV în monoterapie ar salva celulele de apoptoza spontană crescută, aceștia au co-exprimat shRNA 13L și 16E în celulele HeLa și au găsit apoptoză spontană crescută. Acest lucru a confirmat în continuare cerința critică a MADD, și nu a DENN-SV, pentru supraviețuirea celulelor (Figura 8).

Modularea descendentă a MADD provoacă apoptoză spontană. Celulele HeLa au fost infectate cu lentivirusurile care exprimă shent-ul indicat. La șaptezeci și două de ore după transducție ( A ), s-a efectuat o reacție în lanț cu transcripție inversă-polimerază așa cum s-a descris mai sus, iar produsele au fost separate pe un gel de agaroză 2%. ( b ) Colorarea Hoechst a fost efectuată pentru a determina apoptoza spontană.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a demonstra în mod clar rolul fundamental al MADD în supraviețuirea celulei, am generat celule HeLa exprimând stabil MADD-YFP-Mut și DENN-SV-YFP-Mut (Figura 1b). Așa cum se arată în Figura 9a, la 72 ore după transducție, Mid-shRNA nu a reușit să moduleze fie MADD-YFP-Mut, nici DENN-SV-YFP-Mut; în timp ce 13L-shRNA poate downmodula atât endogen cât și MADD-YFP-Mut. Interesant este că expresia MADD-YFP-Mut și nu a DENN-SV-YFP-Mut a fost suficientă pentru a preveni apariția apoptozei spontane în celulele Hela tratate cu shRNA Mid (Figura 9b). Rezultate similare au fost obținute în celulele PA-1 (nereprezentate). Aceste rezultate arată clar că MADD singur poate preveni apoptoza spontană a celulelor canceroase.

MADD, nu DENN-SV, poate preveni apoptoza spontană. ( A ) Reacția în lanț IG20-SV de transcripție inversă-polimerază de la celule transfectate permanent fie cu vectorul de control, MADD-YFP-Mut sau DENN-SV-YFP-Mut și infectate cu respectivii viruși care exprimă shRNA timp de 72 de ore. b ) Condensarea nucleară. Celulele HeLa au fost colorate cu Hoechst pentru a determina apoptoza spontană. Datele prezentate sunt reprezentative pentru trei experimente diferite (P