obiecte

abstract

Precizia căutării căii axonale și formarea circuitelor nervoase funcționale sunt cruciale pentru ca organismul să proceseze, să stocheze și să recupereze informații din rețelele interne, precum și din mediu. Se consideră că variațiile migrației axonale duc la formarea buclei și autofasciculare, ceea ce poate duce la un sistem nervos extrem de disfuncțional și, prin urmare, se crede că mecanismul de reglare pentru controlul sinaptogenezei este autoreglarea axonală. Aici vă prezentăm aplicarea unei metode optice fără contact recent dezvoltate, folosind un fascicul laser infrarosu aproape slab focalizat, pentru o ghidare axonală extrem de eficientă și pentru a demonstra formarea buclelor axonale în neuronii corticali, care arată că neuronii corticali înșiși pot fasciculează în opoziție la evitarea de sine. Capacitatea luminii de a forma o nano-buclă axonală deschide noi căi pentru construirea circuitelor neuronale complexe și conducerea neinvazivă a neuronilor la distanțe mari de lucru pentru a restabili conexiunile și funcțiile neuronale deteriorate.

În plus față de stimuli topografici 17 și chimici 18, au fost folosite o mare varietate de alte metode inovatoare, inclusiv abordări electrice 19, optice 20, 21, 22, 23 și hibride, cum ar fi electrochimice 24, fluxuri optofluide 25 și fotochimice 26 stimuli . în scopuri de ghidare axonală. În timp ce metodele optice existente se bazează pe principiile conducerii atractive, am constatat că fasciculele laser în apropiere de infraroșu (NIR) pot acționa ca indicii de respingere 27, 28. În acest caz, am folosit un fascicul laser NIR slab concentrat pentru a ghida axonii corticali ai șobolanilor într-un mod extrem de eficient, ceea ce ne-a permis să formăm bucle cu raze diferite și să observăm fascicularea axonală pentru prima dată. Datorită implementării și integrării accelerate a acestei tehnologii cu alte instrumente de manipulare optică și imagistică, reprezentăm un instrument eficient pentru construirea și studiul blocurilor de bază ale circuitelor neuronale in vitro cu înaltă fidelitate și în cele din urmă pentru înțelegerea și controlul circuitelor neuronale complexe in vivo în domenii spațiale și temporale. În cele din urmă, această metodă poate oferi, de asemenea, noi oportunități pentru tratamentul tulburărilor sistemului nervos asociate cu nealinierea axonilor.

rezultate si discutii

Deși s-a dovedit că lumina acționează ca o etichetă atractivă în timp ce lovește direct conul de creștere (cu planuri specifice de iradiere), am folosit efectul distanței folosind o sursă de lumină NIR slab concentrată, despre care în prezent credem că este fototermică. 28, 29. Axonii cu o rată de creștere> 20 μm/h au fost selectați aleatoriu pentru formarea buclei. Mai mult, pata laserului nu se aplică doar la distanța transversală (2 - 8 μm) de conul de creștere (GC), ci obiectivul NA scăzut (0,5 NA, obiectivul microscopului 20 ×) este la distanța axială

axonului

a) Linie optică cu cameră de mediu. (b) Panoul din stânga: imaginea unui axon tipic înainte și după o virare. Poziția punctului laser este indicată printr-un cerc roșu. Panoul din dreapta: suprapunere temporizată a arborelui axonal după interacțiunea cu fasciculul laser. Direcția conului inițial de creștere indicată de o săgeată. Liniile pseudo-colorate trasate pe axul axonal în diferite puncte de timp și suprapuse. Intervalul de timp dintre culori este de 2 minute în bara de culori.

Imagine la dimensiune completă

a) Imagini de contrast de fază a doi neuroni corticali de șobolan (a) înainte și (b) după ghidare optică. Un dreptunghi care arată zona de interes pentru ghidare optică. Scara: 50 μm. (c - k) Imagini în interval de timp ale unei bucle axonale fabricate optic care arată pozițiile punctelor laser (cercuri roșii). (l - n) Autofascicularea axonului. Scara: 10 μm.

Imagine la dimensiune completă

Formarea buclelor (Fig. 2k) demonstrează capacitatea fără precedent a acestei metode de repulsie optică, de a realiza ghidare circulară completă fără limite topografice, care ar trebui să permită crearea de circuite neuronale complexe in situ. Interesant este că raza de curbură a buclei formată prin această metodă poate fi observată ca

5 μm (egal cu cea mai mică rază detectată în bucle aleatorii formate spontan in vitro, Supliment. Fig. 1). După formarea buclei ghidate optic (Fig. 2k), deși am presupus că GC va avansa pe axul axonal original, axonul cortical ghidat optic al șobolanului a continuat să crească unul lângă altul, cu auto-clătinare observată pe distanțe și timp mari (Fig. 2 l). - n). Acest lucru ne face să credem că ipoteza de autocontrol poate să nu fie universală pentru toate tipurile de axoni și că neuronii specifici o pot folosi în avantajul lor în formarea fasciculelor cu ei înșiși, reducând astfel sinaptogeneza 16. Supl. Filmele 3 și 4 prezintă zona mărită și întregul câmp vizual al formării buclei O și procesul de autofasculare prin modularea spațiu-timp a tacului respingător indus de laser. Suprapunerile pseudo-colorate ale conturului axonal axonal preluate din procesul de formare a buclei sunt prezentate în Supliment. FIG.

a) Cinetica unghiului de rotație al axonului cortical controlat de un laser folosind un obiectiv cu microscop de 20x. (b) Grafice cumulative pentru distribuția unghiurilor de rotație axonale ghidate cu laser. c) Cinetica creșterii axonale nete în timpul ghidării optice. (d) Rata de creștere în timpul rotației în mai multe etape a fasciculului laser modulat în timp. (e) Imagini ale conducției axiale cu un interval de timp (3 minute) utilizând un profil de fascicul de formă spațială (marcat cu o linie roșie). Scara: 10 μm.

Imagine la dimensiune completă

Am investigat în continuare dacă buclele axonale pot fi formate cu raze mai mici de curbură prin intermediul unei etichete de lumină pulsată și dacă autofascicularea axonului cortical este modulată de o astfel de rotire ascuțită. În FIG. 4A prezintă imagini time-lapse (a - j) ale producției asistate de laser a unei bucle axonale cu o rază de curbură de 5 μm) s-a dovedit a fi stabilă, stabilitatea buclelor mai mici a scăzut cu raza de buclă descrescătoare (Fig. 4C).

(A) Construcția buclei I prin metoda ghidării axonale laser. (a - j) Imagini de contrast de fază ale unei bucle I fabricate optic cu un interval de timp (3 minute) de asamblare completă a axonului cortical înapoi la arborele său. Scara: 10 μm. (B) Producția de bucle electronice asistată de laser. (a - d) Imagini de contrast de fază ale concretizării optice a buclei în neuronul cortical de șobolan (4 minute). (e - h) Autocurățarea axonului ghidat optic și reducerea razei de curbură a buclei realizate optic. Scara: 10 μm. Pozițiile punctelor laser sunt indicate prin cercuri roșii. (C) Cinetica schimbării diametrului buclei pentru buclele axonale cu raze diferite. (D) Raza graficului vs forța echivalentă pentru axoni cu număr diferit de microtubuli (10-100 în trepte de 10). Liniile verticale (roșu: I-loop, negru: e-loop, albastru: o-loop) indică cele trei raze finale de curbură realizate ale buclelor axonale.

Imagine la dimensiune completă

(A) Seria Time-lapse de imagini cu contrast de fază care demonstrează prevenirea formării prospective a buclei prin refulare optică în axonii corticali de șobolan (punct laser marcat cu un cerc roșu) Punctul laser a fost mutat după 8 minute și oprit după 23 de minute. Se observă că Axon este fascinat de sine în timpul perioadei de observare după 26 de minute. (B) Dinamica unghiului relativ rotit în timpul prevenirii buclei datorită ghidării optice inițiale (săgeată roșie scurtă) și secundară (săgeată roșie lungă). (C) Dinamica lungimii relative în timpul prevenirii buclei datorită liniilor optice inițiale (săgeată roșie scurtă) și secundare (săgeată roșie lungă). Capătul liniei optice este marcat cu o săgeată neagră.

Imagine la dimensiune completă

Odată cu progresele recente în noile instrumente de stimulare optică și imagistică 40, ar fi posibil să se efectueze teste neinvazive tot optice ale naturii de calcul a unui circuit neuronal generat optic. În plus, utilizând un laser cu infraroșu pentru utilizare în sensibilizarea neuronilor prin transfectarea genelor care codifică opsina 46, precum și două stimulări fotogenice optogenetice 40 și imagistica optică 40, 41, se poate realiza un progres rapid în controlul complet optic al formării și activității circuitului neuronal. Deși s-a constatat că acest ghid repulsiv este omniprezent pentru diferite tipuri de neuroni (celule ganglionare peștișor, celule neuronice corticale de șobolan și celule ganglionare ale rădăcinii dorsale), cu integrarea tehnologiilor nanofotonice bio și conformale 47, noi posibilități pentru sensibilizarea genetică a neuronilor specifici vor apărea.care răspund la lungimi de undă laser specifice și astfel le conduc în mod selectiv in vivo .

concluzii

metode

Procedurile experimentale descrise în acest manuscris au fost efectuate în conformitate cu Universitatea din Texas în protocolul Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Arlington.

Cultura neuronilor corticali

Toate procedurile experimentale au fost efectuate conform protocolului Comitetului instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor. Neuronii corticali au fost izolați de la embrioni embrionari de șobolan timp de 18 zile. Țesuturile corticale au fost detașate, curățate (stratul meningeal), disociat enzimatic (0,15% tripsină în mediu L-15) timp de 20 de minute la 37 ° C. Neuronii corticali disociați (100.000/dispozitiv) au fost inoculați pe poli-D-lizină (PDL, 0,01%, Sigma) sticlă acoperită pre-acoperită cu barieră de polidimetilsiloxan (Sylgard 184, Dow corning) și mediu de cultură fără ser (mediu neurobazal). suplimentat cu B-27 cu BDNF și NT-3, 10 ng/ml) a fost schimbat la fiecare 3 zile.

Setări pentru navigare axonală

O schemă a platformei pentru navigație axonală este prezentată în FIG. 1a. Fasciculul de infraroșu reglabil Ti: Safir (MaiTai HP, Newport-SpectraPhysics), care funcționează în modul oprit, a fost extins și transmis prin oglinzi pliabile către portul laser din spate al unui microscop inversat (Ti-U Eclipse, Nikon). ). Un obturator mecanic (Uniblitz) a fost folosit pentru a impulsiona fasciculul laser (20 ms PORNIT și 20 ms OPRIT) pentru a preveni creșterea continuă a temperaturii sau constrângerea mecanică. O oglindă dicroică a fost utilizată pentru a direcționa fasciculul în diafragma din spate a obiectivului cu un microscop de 20x (Ph1, NA = 0,5, Nikon), transmitând lumină vizibilă pentru a afișa contrastul de fază. Un filtru de tăiere IR a fost utilizat în calea imagistică pentru a elimina fasciculul laser reflectat pentru a obține un CCD (fotometrie). Lungimea de undă și puterea fasciculului laser au fost ajustate de software pentru a obține o putere a fasciculului de eșantion-80 mW. Puterea laserului în planul de probă a fost calculată prin înmulțirea factorului de transmisie țintă cu puterea măsurată la diafragma posterioară a obiectivului microscopului folosind un contor de lumină standard (PM 100D, Thorlabs). Pentru a obține ghidarea optică, fasciculul a fost plasat în afara filopodiei axonilor, asimetric așezat în calea axonilor în creștere.

Măsurarea orientării conului de creștere

Orientarea axonală inițială este indicată ca referință și următoarele ramuri au fost măsurate în raport cu această poziție inițială. Prin aplicarea unei forțe asupra conului de creștere, conul de creștere previne și pata laserului. Pentru a face acest lucru, s-a constatat că GC nu numai că se îndepărtează de punctul laser, ci și se întoarce înapoi. Această dinamică de rotație a fost cuantificată prin înregistrarea schimbării în proiecția conului de creștere pe o suprafață plană utilizând software-ul Image J. Ori de câte ori GC se ridică de la suprafață, vedem doar lungimile proiectate în direcțiile X și Y. putem atinge cu ușurință unghiul de rotație.

Calcul teoretic al forței echivalente necesare pentru determinarea razei de îndoire în direcția axonală

Microtubulii sunt fibre lungi care servesc drept căi pentru proteinele motorii intercelulare și facilitează funcțiile structurale în celulele eucariote. Într-un axon tipic, se crede că 10 până la 100 de astfel de microtubuli sunt prezenți în orice secțiune transversală dată a arborelui axonal. Procesele de polimerizare a conului de creștere axonală sunt modulate asimetric printr-un gradient fototermic generat de un fascicul laser cu infraroșu apropiat, rezultând o „forță echivalentă” transmisă chimic. Pentru a analiza deformarea sau îndoirea unui axon datorită forței la vârful acestuia (con de creștere), am modelat axonul ca un fascicul de secțiune transversală regulată și uniformă, realizat din material elastic liniar (microtubuli cu o rigiditate cunoscută de 48 de îndoiri ). ), care este omogenă și izotropă cu sarcina concentrată la terminalul axonal. Metodologiile utilizate pentru a cuantifica aceste abateri pot fi, în principiu, clasificate în metode analitice sau analitice. Metoda analitică se bazează pe teoria Euler-Bernoulli (EB), care oferă un mijloc de cuantificare a acestor abateri. Apoi, metoda elementului finit este utilizată pentru a obține soluția razei de curbură de îndoire a arborelui axonal la o forță constantă pe vârf. Detalii descrise în metodele suplimentare.