obiecte
abstract
Depunerile de grăsime subcutanată și intramusculară sunt o evaluare caracteristică importantă a produselor din carne de vită gătită. Marmorarea, identificată ca conținutul de grăsime intramusculară, contribuie la sensibilitatea, suculența și gustul cărnii, care sunt importante pentru calitatea cărnii de vită. În general, țesutul subcutanat are prioritate pentru umplerea cu adipocite, urmat de zone intramusculare, ducând la mai puțină secreție de marmură. Reducerea grăsimii subcutanate și îmbunătățirea acumulării de lipide intramusculare în producția modernă de carne de vită rămân o provocare majoră 1. Adipogeneza, procesul prin care pre-adipocitele se diferențiază în adipocite, joacă un rol crucial în acumularea de țesut adipos la animale 2, 3. Înțelegerea exactă a mecanismelor moleculare de depozitare a grăsimii din carne de vită este esențială pentru producția de carne de vită gătită de înaltă calitate.
În ultimii ani, a existat o utilizare crescută a secvențierii transcriptomului profund pentru a identifica miARN exprimate diferențial, precum și posibilitatea de a descoperi noi transcrieri, inclusiv noi izoforme alternative și miARN 4, 5, 6, 7. Odată cu dezvoltarea rapidă a secvențierii următoarei generații (NGS), studiul miARN-urilor devine mai realizabil decât înainte de 8, 9, 10, 11. Depunerea de grăsime este un proces biologic complex în care miARN-urile pot juca un rol de reglare. În țesutul adipos, dovezile acumulate indică în mod clar că miARN-urile joacă un rol important în diferențierea adipocitelor și metabolismul lipidic 12, 13. S-a găsit că multe miARN cum ar fi let-7 14, miR-143 15, 16, 17, miR-17-5p 18, miR-14 19 și miR-33 20, 21, 22 reglează diferențierea adipocitelor și lipogeneza prin diferite semnalizări căi, inclusiv Wnt, MAPK, reglarea ciclului celular și căile insulinei. Receptorii nucleari precum CCAAT/proteinele care leagă amplificatorul (C/EBP), receptorul activat cu proliferatorul peroxizomului (PPAR) și proteinele care leagă elementul sterol (SREBP) sunt de asemenea importante. Aceste descoperiri sugerează că miARN-urile pot fi implicate în acumularea de lipide bovine în țesutul adipos și în mușchi.
S-a dovedit a fi o strategie viabilă de investigare a mecanismelor adipogenezei și acumulării țesutului adipos prin compararea tiparelor de expresie miARN și/sau mARN între diferite rase de bovine. Wang și colab. 23 compară un model de expresie a genelor de grăsime intramusculară între hibrizii Wagyu × Hereford și Piemontese × Hereford și un set de gene legate de adipogeneză și lipogeneză, cum ar fi Adiponectina (ADIPOQ), Stearoyl-CoA desaturaza (SCD) și hormonul inductor al tiroidei. proteine (THRSP), au fost up-reglementate în grupul Wagyu × Hereford 23. Un alt studiu a comparat, de asemenea, profilurile de expresie miARN ale țesutului adipos subcutanat de la mai mulți hibrizi din ramura 24. Compararea bovinelor de rasă pură cu diferite caracteristici de depozitare a grăsimilor va oferi câteva informații noi cu privire la rolurile diferitelor miARN.
Vitele Wagyu sunt renumite pentru marmorarea lor ridicată, adică niveluri ridicate de acumulare intramusculară de lipide, în timp ce o altă fermă de bovine cunoscută, bovinele Holstein, are mult mai puțină marmorare în comparație cu Wagyu 25, 26. Diferența de stocare a grăsimilor între bovinele Wagyu și Holstein atrage multă atenție atunci când se cercetează mecanismul comparativ în domeniul adipogenezei și lipogenezei bovine. Studiile anterioare privind diferența de depozitare a grăsimilor între bovinele Wagyu și Holstein s-au concentrat în principal pe expresia diferențială a genelor specifice, cum ar fi SCD 27 și factorul de preadipocit 1 (Pref-1) 25. Până în prezent, nu se cunoaște nicio diferență în modelul de expresie miARN între carnea de vită Wagyu și Holstein. În studiul de față, a fost efectuat un ecran de secvență cu un randament ridicat pentru a compara nivelurile de expresie miARN ale țesutului adipos subcutanat între Wagya și Holstein. Scopul nostru este de a identifica posibili regulatori miARN de acumulare a țesutului adipos și de a oferi noi informații despre posibilele mecanisme de depozitare a grăsimii bovine.
Rezultatul
Construirea de mici biblioteci de ARN
Pentru a identifica miARN-urile adipos exprimate diferențial în creșterea înapoi între bovinele Wagyu (W) și Holstein (H), am construit biblioteci mici de ARN W și H. Folosind secvențierea Illumina, s-au obținut un total de 12.435.335 și 10.962.269 de date brute din bibliotecile W și H. După secvențe de calitate scăzută, poliA, secvențe mai scurte de 18 sau mai mari de 45 nt și secvențe repetate, 10, 974, 628 (88, 32 %) și 9, 417, 372 (85, 96%) citiri pure în bibliotecile W și H au fost obținute în cele din urmă pentru o analiză ulterioară (Tabelul 1). Distribuția mică a lungimii ARN a celor două biblioteci a arătat că cele mai abundente specii aveau o lungime de 21-22 nt, ceea ce reprezintă un interval tipic de mărime pentru produsele derivate din Dicer (Fig. 1). Aceste curățări au fost apoi aliniate cu baza de date Rfam pentru a filtra ARN-uri necodificatoare, cum ar fi ARNt, ARNr, snoARN și snARN. În general, 35, 28% și 33, 46% diferite valori ale ARN-urilor mici totale din bibliotecile W și H au fost identificate ca miARN conservate, indicând că secvențierea în acest studiu a avut succes (Fig. 2).
Tabel în dimensiune completă
Imagine la dimensiune completă
Imagine la dimensiune completă
Apoi, contoare filtrate au fost aliniate cu genomul bovin și secvențele de ARNm mapate au fost selectate astfel încât BLAST versus miRBază să identifice miARN conservate și să le calculeze nivelurile de expresie. 208 miARN conservate au fost identificate cu succes atât în bibliotecile W, cât și în H. În plus, 48 miARN au fost exprimate în mod specific în grăsimea din spatele bovinelor Holstein și 14 miARN au fost exprimate numai la bovinele Wagyu (Fig. 3). Secvențele care nu se potriveau cu miARN conservate au fost folosite pentru a prezice potențialele miARN. Analiza valorilor de transcriere pe milion (TPM) a arătat că în bibliotecile W și H, primele zece miARN cu număr mare au reprezentat 60% din miARN-urile totale, inclusiv let-7 14, miR-143 15, 16, 17, miR-21-5p 28, miR- 27b 29, 30, 31 și miR-378 32, despre care se spune că sunt implicate anterior în diferențierea adipocitelor (Fig. 4).
Imagine la dimensiune completă
Imagine la dimensiune completă
Analiza miRNA exprimată diferențial între bovinele Wagyu și Holstein
În acest studiu de secvențiere, nivelul expresiei miARN care a fost exprimat în ambele biblioteci a fost cuantificat de TPM dacă TPM cu | log2FC | ≥ 1 și valoarea p ajustată de FDR
Imagine la dimensiune completă
Adnotarea căilor GO și KEGG ale genelor țintă miARN
Analiza interacțiunii miARN-proteină
Rețeaua de interacțiune miARN-proteină a fost construită pentru a releva relația genelor țintă prezise în calea de semnalizare PPAR, iar miARN-urile au fost ghidate pentru a identifica potențiali regulatori (Fig. 6). În conformitate cu datele prezentate în FIG. 5 rezultate arată că PPARα și RXRα au jucat un rol central în calea de semnalizare PPAR și pot fi ținte reglementate de bta-miR-196b și bta-miR-874.
Imagine la dimensiune completă
Validarea secvențierii miARN prin qPCR
Nivelul de expresie a 4 miARN exprimate diferențial a fost selectat și verificat prin qRT-PCR (Fig. 7). În concordanță cu datele de secvențiere miARN, rezultatele qRT-PCR din 4 miARN selectate aleatoriu au prezentat un model de expresie similar în cele două biblioteci, confirmând în continuare că datele secvenței noastre au fost fiabile.
Compararea valorilor relative ale expresiei ( A ) și TPM ( B ) din patru miARN selectați diferențial. ( A ) Nivelul de expresie relativă a miARN selectate a fost măsurat prin PCR cantitativă în timp real, datele au fost exprimate ca medie ± SD. **, *** p 35. Cu toate acestea, rolul lor exact al miARN în depunerea grăsimii bovine este departe de a fi clar. În acest studiu, am efectuat secvențierea ARN cu randament ridicat pentru a identifica miARN asociate cu diferite proprietăți de depozitare a grăsimilor între bovinele Wagyu și Holstein. În acest studiu, am constatat că nivelurile de expresie ale miR-142-3p, miR-379 și miR-196a au fost mai mari în țesutul adipos al bovinelor Wagyu comparativ cu Holstein (Tabelul 2). Studiile lui Chartoumpekis și colab. (2012) și Meale și colab. (2014) au raportat, de asemenea, că aceste miARN reglează lipogeneza și depozitarea grăsimilor la alte animale 36, 37. În ansamblu, acest studiu arată că niveluri mai ridicate de grăsime intramusculară la bovinele Wagyu pot fi atribuite în parte acestor 3 miARN extrem de exprimate.
Interesant este că bta-miR-320a a fost, de asemenea, prezentat în primii zece miARN extrem de abundenți și a prezentat un profil de expresie semnificativ diferit între bovinele Wagyu și Holstein (P 38. Familia MiR-320 promovează adipogeneza prin blocarea altor diferențieri MSC (adică, osteoblaste) Un alt studiu a mai constatat că miR-320 reglează rezistența la insulină prin calea de semnalizare insulină-PI3K 39. Împreună cu rezultatul nostru actual, miR-320 joacă un rol important în adipogeneză și, prin urmare, diferența de stocare a grăsimilor între bovinele Wagyu și Holstein.
În plus, am constatat că nivelurile de expresie ale miR-136, miR-190a, miR-411a, miR-708, miR-1940 și miR-2887 au fost semnificativ mai mari în Wagyu comparativ cu bovinele Holstein (P 40. Calea de semnalizare Notch este o cale cheie în ontogeneza și diferențierea celulară 41. Mai multe studii anterioare au arătat rolul căii Notch în diferențierea pre-adipocite și au sugerat că activarea căii de semnalizare Notch poate inhiba diferențierea adipocitelor 42, 43, 44, 45. studiu prezent, 8 miARN-uri țintă gene, inclusiv proteina Delta-like 1 (DLL1), omologul proteinei omologate pe segmentul de polaritate DVL-3 (DVL3), histona acetiltransferază KAT2A (KAT2A), subunitatea gamma-secretază PEN-2 (PSENEN), factorul de transcripție HES-5 (HES5)), histona deacetilaza 1 (HDAC1), E3 ubiquitin-protein ligase DTX4 (DTX4) și E3 ubiquitin-protein ligase DTX2 (DTX2) au fost implicate în calea de semnalizare Notch, sugerând că unele miRNA reglementează diferențierea adipocitelor prin calea Notch.
concluzie
În acest studiu, am folosit secvențierea ARN-ului de mare viteză pentru a compara nivelul miARN-urilor cu grăsime din spate între bovinele Wagyu și Holstein. Pe baza constatărilor noastre, acesta este primul studiu al profilurilor miARN de țesut adipos între bovinele Wagyu și Holstein pentru a investiga posibilele mecanisme de depozitare a grăsimilor. În studiul nostru, sunt identificate mai multe miARN care pot regla adipogeneza prin țintele lor și căile conexe. Dintre acestea, bta-miR-196b reglat în sus și bta-miR-874 reglat în jos pot afecta traducerea semnalului căii PPAR de către țintele lor implicate în cale și, ulterior, reglează depozitarea grăsimilor. Rezultatele noastre oferă informații despre microARN-uri care au fost exprimate diferențial în grăsimea subcutanată a două rase diferite de animale bovine cu niveluri diferite de depunere de marmură, oferind o mai bună înțelegere a mecanismelor moleculare ale depunerii de grăsime bovină.
Materiale și metode
Animale experimentale și pregătirea probelor
Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu directivele și reglementările relevante solicitate de Ministerul Agriculturii din Republica Populară Chineză. Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Institutul de Științe Animale, Academia Chineză de Științe Agricole, unde a fost efectuat experimentul.
În acest studiu, bovinele Wagyu și Holstein au fost furnizate de Beijing Huairou Wagyu Technology CO (Beijing, China) și de compania de producție a cărnii Langfang Xingcheng (Hebei, China). Cinci bovine Wagyu masculi și cinci bovine Holstein masculine, cu vârsta de aproximativ 30 de luni, au fost selectate pentru colectarea țesutului adipos subcutanat dorsal între coastele 12 și 13. Țesutul adipos a fost îndepărtat imediat după uciderea animalelor și depozitat imediat în azot lichid pentru extragerea ulterioară a ARN-ului.
Construirea și secvențierea unor mici biblioteci de ARN
ARN-ul total a fost extras din țesutul adipos folosind TRIzol (Invitrogen, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Alicote ale ARN-ului total (10 μg) de la cinci bovine Wagyu sau Holstein au fost amestecate în cantități egale pentru a forma o probă colectată ca biblioteca W (pentru bovinele Wagyu) și H (pentru bovinele Holstein). Concentrația totală de ARN a fost măsurată cu un spectrofotometru NanoDrop 2000 (sistem GE, SUA) și un bioanalizator Agilent 2100 (sistem GE, SUA). ARN-urile mici au fost izolate folosind PEG-8000 (Sigma, SUA), ARN-ul a fost ligat cu un adaptor 3 'și apoi fracționat cu dimensiunea de 15% prin denaturarea electroforezei pe gel de poliacrilamidă. Au fost obținute fracții de 36 până la 44 nt și legate de adaptorul 5 '. Fracțiile mici de ARN au fost transcrise invers și apoi amplificate prin PCR, ampliconii au fost încărcați pe un gel de agaroză de 3,5%, fracțiile 140-160 bp au fost obținute ca bibliotecă. Bibliotecile mici de ARN au fost examinate cu qPCR și concentrația a fost mai mare de 2 nM, indicând faptul că bibliotecile erau fiabile. Bibliotecile W și H au fost apoi secvențiate folosind Hiseq-2000.
Analiza bioinformatică a secvențelor mici de ARN
Citirile brute obținute din biblioteci au fost procesate mai întâi cu software-ul Cutadapt și setul de instrumente FASTX pentru a obține o citire curată în fișierele FASTQ. Evaluarea calității datelor secvenței, incluzând distribuția de bază, raportul GC, duplicarea PCR și frecvența deformării, au fost evaluate utilizând software-ul FastQC. Funcția FASTQ Information din trusa de instrumente FASTX a fost utilizată pentru a analiza distribuția în lungime a secvențelor de ARN. Secvențe de ARN mici mici între 18 și 45 nt în lungime obținute din biblioteci au fost comparate cu baza de date Rfam (Rfam 10.0) folosind Rfamscan și Blastn pentru a elimina ARNr, scARN, snARN, snoARN și ARNt 51. Restul diferitelor secvențe au fost folosite pentru a căuta miRBase (miRBase19.0) folosind miRDeep2 pentru a identifica miARN conservate 52, 53. Pentru a prezice noi candidați miARN, secvențele au fost mapate în genomul bovinului de la ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-76/fasta/bos_taurus/dna/ folosind bowtie2 și miRDeep2 a fost calculată.
Identificarea miRNA exprimată diferențial și predicția țintei
Numărul de miARN conservate identificate din miRDeep2 între bibliotecile W și H au fost utilizate pentru a analiza expresia 54. Pentru a evalua semnificația diferenței în expresia miARN, a fost folosit programul „edgeR” 55 pentru pachetul R pentru a calcula setul de date de numărare. Merită remarcat pentru a evita rezultatele fals pozitive, doar TPM s | log2FC | ≥ 1 și valoarea p ajustată FDR 56 .
Ontologia genică (GO) și adnotarea Enciclopediei Kyoto a genelor și genomelor (KEGG) gene țintă miARN și analiza interacțiunii miARN-proteine
Analiza GO a genelor țintă de miARN testate a fost efectuată pentru a prezice procesele și funcțiile biologice potențiale care au fost cel mai probabil afectate de miARN folosind baza de date Adnotare, vizualizare și integrare (DAVID) 57. Cele mai importante categorii GO, funcții biologice și diferite căi canonice au fost analizate pentru ținte specifice miARN-ului, precum și pentru toate țintele testate, pe baza unei supraexpresii genetice semnificative folosind testul Fisher. Apoi, genele țintă miARN au fost adnotate în calea KEGG folosind DAVID 58. În plus, am folosit baza de date String (//string-db.org/) pentru a prezice rețeaua de interacțiune miARN-ARNm a genei țintă.
qPCR validarea miARN identificate
Nivelurile de expresie ale celor 3 miARN exprimate diferențial, bta-miR-320a, bta-miR-874 și bta-miR-1247-3p și noul miARN preconizat chr4_8522, au fost selectate aleatoriu și verificate prin qRT-PCR. Pe scurt, ARN-ul total extras din grăsimea din spate a fost transcris invers pentru a obține ADNc. O reacție PCR în timp real a fost apoi efectuată pentru a măsura nivelurile de expresie miARN. Toate reacțiile au fost efectuate în triplicat cu un volum de reacție de 10 μl (5 μl 2 x LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 0,2 μl primer primer PCR, 0,2 μl primer invers PCR, 1 μl ADNc și 3,6 μl nuclează). H2O) și incubat (95 ° C timp de 10 minute, apoi 40 de cicluri la 95 ° C timp de 10 secunde, 60 ° C timp de 30 de secunde). O metodă comparativă Ct și o genă miRNA de control intern U6 au fost utilizate pentru a calcula nivelurile relative de expresie a genei. Toate reacțiile qPCR au dat un singur vârf pe curba de disociere, indicând amplificări specifice.
analize statistice
TPM a fost utilizat pentru a evalua nivelurile de expresie miARN și a fost calculat conform formulei. În formulă, bibliotecarea reprezintă numărul total al tuturor miARN identificate, iar miR_readscounts indică numărul de miARN specifice.
În procesarea analizei de îmbogățire a genei țintă, distribuția hipergeometrică și analiza exactă Fisher au fost utilizate pentru a calcula valorile p folosind formula de mai jos. În formula a reprezintă numărul de gene țintă din termenul sau calea GO care urmează să fie detectate, b reprezintă gene non-țintă, numărul de gene ne-țintă înlocuiește numărul de gene ne-țintă din același termen, c reprezintă numărul de gene țintă în termeni ulteriori, în timp ce d reprezintă numărul de gene non-țintă în alte date. Deoarece acesta este un test multiplu, valorile p sunt ajustate prin metoda ratei de descoperire falsă (FDR).
Toate datele qPCR sunt prezentate ca medie ± SD. Când s-au făcut comparații, testul t Student a fost efectuat folosind SPSS 17, 0 (IBM, SUA) și p