Rezumat:

Depleția celulei T din măduva osoasă prin elutriere centrifugă contracurentă reduce riscul bolii grefă contra gazdă (GVHD). Cu toate acestea, datorită ratelor ridicate de eșec al grefei și recăderii, elutrierea singură nu a îmbunătățit supraviețuirea. Am efectuat un studiu clinic de fază II la 54 de pacienți copii și adolescenți pentru a determina dacă selecția CD34 + pentru salvarea celulelor stem pluripotente din fracția de celule mici îmbunătățește aderența. Grefele prelucrate conțineau în medie 5,5 x 107 celule/kg IBW, 4,7 x 106 CD34 + celule/kg IBW și 6,3 x 105 CD 3+ celule/kg IBW. Pacienții au obținut un ANC> 500 la o mediană de 16 zile și un număr de trombocite> 20.000 la o mediană de 28 de zile. Incidența GVHD semnificativă clinic a fost de 19%. Un total de 10 pacienți înscriși în acest studiu au prezentat eșecul grefei, cu opt din cei 14 pacienți transplantați pentru indicații benigne care nu au putut fi stabilite stabil. Eșecul grefei a fost asociat semnificativ statistic cu un diagnostic nediagnosticat (P 3, 4, 5, această abordare prezintă un risc potențial de creștere a morbidității și mortalității legate de transplant.

Elutrierea centrifugă contracurent (CCE) separă celulele măduvei osoase pe baza proprietăților de sedimentare și s-a demonstrat că asigură recuperarea celulară aproape completă în mai multe fracțiuni de dimensiuni. 6 Limfocitele sunt separate în fracții de celule mici și medii, în timp ce fracția de celule mari conține cea mai mare parte a CFU-GM din colecția măduvei osoase și este de 100 până la 1000 de ori epuizată de limfocite. Studiile timpurii din această instituție au arătat că, atunci când o fracțiune celulară mare este utilizată ca singură componentă a grefei, incidența GVHD semnificativă clinic poate fi redusă semnificativ. Cu toate acestea, incidența eșecului grefei a crescut la 10%. Pacienții cărora li s-au administrat doze mai mici de limfocite (5 x 105 față de 1 × 106 limfocite/kg greutate corporală ideală) au prezentat aderența întârziată a granulocitelor și a trombocitelor și o incidență ridicată a himerismului hematopoietic mixt, determinată de analiza RFLP a măduvei osoase. Deși alți cercetători au raportat o rată a eșecului grefei de numai 5% numai cu CCE, 10 această rată este mai mare decât cea observată în transplantul de măduvă nemanipulat. 11, 12

În 1990, Jones și colab. 13 a arătat într-un model de șoarece că sunt necesare două clase de celule pentru greutatea cu succes: progenitori angajați care furnizează grefe inițiale, dar neîntreținute și celule stem hematologice pluripotente (PHSC) care asigură greutate întârziată și permanentă. Aceste PHSC copulează cu limfocite în fracțiile de eluție cu celule mici și sunt astfel secretate de alogrefa TCD. Pe această bază, a fost dezvoltat un studiu de fază I folosind selecția CD34 + pentru a obține PHSC din fracțiunea de limfocite mici eluate. 14 Salvarea celulelor CD34 + mici poate reduce semnificativ timpul până la greutate, în timp ce se menține incidența scăzută a GVHD severă observată cu elutrierea standard a TCD.

Au fost apoi efectuate studii clinice de fază II pentru a elucida în continuare rolul epuizării celulelor T, a măduvei osoase CD34 + la frații asociați și a transplanturilor fără legătură. Rezultatele unui studiu la adulți 15, 16 au arătat că atât GVHD acut, cât și cel cronic au fost semnificativ reduse și că selecția celulelor stem CD34 + a fost asociată cu altoire rapidă și admiteri mai scurte în spital. Incidența de 3,6% a eșecului grefei a fost mai mare decât cea observată la transplanturile de măduvă osoasă nemanipulate, 11, 12, dar ar putea fi explicată prin factori de risc cunoscuți la patru din cinci pacienți. Trei pacienți cu LMA au primit o transfuzie de trombocite de la un donator de măduvă osoasă înainte de transplant și au fost astfel aloimunizați în mod specific. Al patrulea pacient a avut un istoric de 3 ani de anemie aplastică care s-a dezvoltat în sindrom mielodisplazic (SMD). Un al cincilea pacient a prezentat insuficiență tardivă a grefei> 155 de zile după BMT în absența infecției cunoscute sau GVHD, iar motivele acestui eșec sunt necunoscute.

Tehnica elutriției de selecție a celulelor stem CD34 + a fost studiată acum la pacienții pediatrici supuși BMT alogenă, iar rezultatele acestui studiu clinic de fază II sunt prezentate aici. La fel ca adulții, acești pacienți au prezentat o reducere semnificativă a GVHD semnificativ clinic și a timpului de transplant. Cu toate acestea, s-a observat o incidență mult mai mare a eșecului grefei la această populație, în special la copiii supuși BMT în tulburări benigne moștenite.

Materiale și metode

Eligibilitatea pacientului

Între 1 ianuarie 1995 și 31 august 2000, pacienții pediatrici cu vârsta cuprinsă între 6 luni și 21 de ani care îndeplineau criteriile specifice de diagnostic și eligibilitate au fost incluși într-unul din cele trei protocoale instituționale care utilizează același tratament pentru grefă. Pacienții înscriși în aceste protocoale de tratament au îndeplinit criteriile de boală stabilite și criteriile de eligibilitate: vârsta peste 6 luni; testarea adecvată a funcției pulmonare (> 75% din valoarea prezisă); fracția de ejecție> 50% demonstrată prin ecocardiogramă sau MUGA; funcție hepatică adecvată, așa cum este indicat de bilirubina 17 metilprednisolonă în doză de 10 mg/kg în zilele anterioare transplantului -3, -2 și -1 pentru a elimina limfocitele gazde reziduale; metilprednisolon în doză de 0,5 mg/kg/zi iv de la 7 la 14 zile și 1,0 mg/kg/zi iv de la 15 la 28 zile; prednison pe cale orală în doză de 0,8 mg/kg/zi din ziua 29 până în 42, în doză de 0,5 mg/kg în intervalul 43-56 zile, în doză de 0,2 mg/kg/zi în intervalul 57-71 zile și la o doză de 0,2 mg/kg o dată la două zile din zile. 72-79. Steroizii au fost întrerupți după 79 de zile, când testul de stimulare ACTH a arătat producția de steroizi endogeni.

Selecție CCE și CD34 +

Separarea celulară prin CCE a fost descrisă mai sus. 18 celule de măduvă osoasă manta Buffy au fost preparate pe un sistem de afereză COBE Spectra configurat pentru prelucrarea măduvei osoase (COBE BCT, Lakewood, CO, SUA). Celulele care conțin 96% din celulele mononucleare recoltate au fost apoi plasate într-un rotor și cameră de eluție Beckman JE-10x (Beckman Instruments, Palo Alto, CA, SUA) la 20 ° C, un debit de 50 ml/min și o viteză a rotorului de 3000 rpm. Au fost colectate trei fracții: (1) o fracțiune celulară mică compusă din eritrocite și limfocite mici; (2) o fracțiune de celule mijlocii compusă din limfocite mari, granulocite și monocite; și (3) o fracție mare de rotor compusă din granulocite, monocite, explozii și 11 După elutriere, fracția de saturație și fracțiile de dimensiuni mici și mijlocii au fost reunite și incubate cu anticorpul anti-CD34 de șoarece. Celulele au fost apoi concentrate, spălate și resuspendate, iar celulele CD34 + au fost recoltate folosind un concentrator automat de celule stem Ceprate SC (Cellpro, Bothell, WA, SUA). Puritatea celulelor CD34 + a fost verificată prin citometrie în flux folosind un anticorp monoclonal conjugat cu ficoeritrina la CD34 (HPCA-2) și CD-3 și un anticorp monoclonal conjugat cu fluoresceină izotiocianat care recunoaște CD45 (Becton Dickinson, San Jose, CA, SUA) .,

Evaluarea grefei donatorilor

Aderența inițială a fost determinată de evaluarea zilnică a parametrilor hematologici și examinarea măduvei osoase, dacă este dictată de evoluția clinică. Ziua de greutate a neutrofilelor a fost definită ca prima din trei zile consecutive cu ANC> 500. Grefa de trombocite a fost definită ca prima zi cu un număr de trombocite> 20.000 fără transfuzie de trombocite în ultimele 7 zile. Durabilitatea grefei a fost evaluată în zilele +30, +60, +90, +180 și la 1 și 2 ani după transplant. Analiza chimerizării a fost efectuată cu XY FISH (donator non-asortat sexual) sau cu analiză sondă RFLP/ADN (donator de același sex). Graficarea a fost definită ca recuperare în decurs de 30 de zile cu> 95% donator chimerism. Toți pacienții care nu au îndeplinit acest criteriu au fost clasificați ca pacienți cu insuficiență a grefei. Eșecul secundar al grefei a fost definit ca pierderea sau scăderea permanentă a himerismului donatorului după atingerea greutății primare.

metode statistice

Numărul de celule a fost distribuit aproximativ în mod normal după transformarea logaritmică. Prin urmare, sunt date numerele geometrice ale celulelor și numărul de celule transformate în jurnal a fost utilizat în toate analizele statistice. Timpii evenimentelor au fost măsurați de la data BMT la pacienții cenzurați la momentul decesului sau data ultimei monitorizări. Distribuția în timp a evenimentului a fost estimată utilizând metoda de limitare a produsului Kaplan și Meier 19 și intervalele de încredere determinate utilizând formula 20 a lui Greenwood. Data și stadiul GVHD au fost determinate de echipa de tratament sau de echipa GVHD și au fost înregistrate conform criteriilor publicate. 21 de pacienți au fost evaluați pentru GVHD acut dacă au supraviețuit după ziua 30 după BMT sau au dezvoltat GVHD înainte de ziua 30. Pacienții care au supraviețuit la 90 de zile după BMT au fost evaluați pentru GVHD cronic. Testul exact al lui Fisher și testele de evaluare Wilcoxon au fost utilizate pentru a determina eterogenitatea. Testul t al studentului a fost folosit pentru a compara cele două mijloace. Analiza a fost efectuată utilizând software-ul statistic STATA.

Rezultatul

Caracteristici clinice

Între ianuarie 1995 și august 2000, 79 de pacienți copii și adolescenți au suferit un BMT alogen inițial la Centrul pentru copii Johns Hopkins. Dintre acești 79 de pacienți, 58 au fost înrolați într-unul din cele trei protocoale instituționale folosind metode identice pentru selectarea celulelor stem TCD și CD34 +. Patru dintre pacienții înrolați au primit în cele din urmă grefe neexpuse din cauza unui număr inadecvat de celule (

ridicată

Relația dintre timpul grefei și doza celulară. A ) corelația dintre doza totală de celule mononucleare și recuperarea trombocitelor; ( b ) corelația dintre doza celulară CD34 + și recuperarea trombocitelor; ( c ) corelația dintre doza celulară CD3 + și recuperarea trombocitelor; ( d ) corelația dintre doza totală de celule mononucleare și regenerarea neutrofilelor; ( e ) corelația dintre doza celulară CD34 + și regenerarea neutrofilelor; ( f ) Corelația dintre doza celulară CD3 + și regenerarea neutrofilelor.

Imagine la dimensiune completă

a prinde

Utilizarea alogrefelor elutrate îmbunătățite prin selecția CD34 + în această populație de pacienți a dus la greutatea mediană a neutrofilelor (ANC> 500) la 16 zile (IÎ 95%: 15-17 zile) și aderența trombocitelor peste 20.000 la 28 de zile (IÎ 95%: 22, 5-32 zile). Pacienții copii și adolescenți care au primit grefe necontrolate în această perioadă de timp au avut un timp mediu de recuperare a neutrofilelor de 19 zile (IÎ 95%: 17-21,5) și un timp mediu de recuperare a trombocitelor de 24,5 zile (IÎ 95%: 21-28).). Timpul până la recuperarea neutrofilelor a fost statistic semnificativ mai rapid la primitorii eluați de grefă (P = 0,009), dar nu a existat nicio diferență statistic semnificativă în rata de recuperare a trombocitelor (P = 0,37). Nu a existat nicio relație între timpul de transplant și doza de celule (Figura 1).

Eșecul alimentării

Dintre cei 54 de pacienți pediatrici cărora li s-au administrat alogrefe CD34 + diluate elutrate, 10 copii (18,5%) au prezentat eșecul grefei. Caracteristicile grefei la pacienții cu insuficiență ale grefei sunt detaliate în Tabelul 3. Niciunul dintre copiii tratați cu măduvă netratată în această perioadă nu a prezentat eșecul grefei. Eșecul grefei a fost asociat semnificativ statistic cu un diagnostic inițial care nu a fost diagnosticat (P 15 a raportat că această complicație a fost depășită în mare măsură prin îmbunătățirea alogrefei de către celulele stem CD34 +. Din cei 110 pacienți adulți tratați în studiul său cu transplanturi identice de frate și manipulare asemănătoare grefei au descris doar cinci pacienți (4,5%) au avut eșecul grefei, iar la patru din cinci pacienți, eșecul grefei a fost explicat de un factor de risc cunoscut, inclusiv anemie aplastică, transfuzii extinse de plăci pre-transplant sau sensibilizare anterioară la antigenii histocompatibilității donatorului, care au fost inexplicabil.la pacienții noștri copii.

Dintre cei 10 pacienți pediatrici cu insuficiență a grefei raportați în acest document, opt au suferit BMT pentru boli benigne. Șapte cazuri de eșec precoce al grefei nu ar putea fi explicate de un număr insuficient de celule din grefă. Numărul mediu de celule mononucleare din acest subgrup de pacienți a fost mai mare decât în ​​întregul grup de grefe eluate (6,38x107 față de 5,5x107) și cea mai mică doză de celule a fost de 2,95 × 107 celule mononucleare/kg IBW. În mod similar, numărul mediu de celule CD34 + și numărul mediu de celule CD3 + au fost mai mari la pacienții cu insuficiență a grefei decât în ​​întregul grup de studiu. Niciunul dintre eșecurile grefei nu a fost explicat prin sensibilizarea HLA anterioară. Deși ambii pacienți cu talasemie au primit numeroase transfuzii de celule roșii din sânge înainte de transplant, niciunul nu a fost de la un donator de măduvă osoasă. În plus, niciunul dintre cei patru pacienți nu a primit vreodată transfuzie de trombocite înainte de BMT.

Toți cei 10 pacienți care au prezentat eșecul grefei au primit profilaxie GVHD cu CSA și patru pacienți cu un donator HLA de familie fără legătură sau incoerent au primit steroizi profilactici. Nivelurile terapeutice de CSA au fost menținute la toți pacienții. Un pacient a dezvoltat GVHD semnificativ clinic. Un dezechilibru de aloreactivitate gazdă versus grefă ar predispune la respingere, în timp ce GVHD ar favoriza o grefă de donator. Acest pacient a avut doar himerism limfoid, iar terapia de salvare a GVHD refractar a fost extrem de limfotoxică.

În studiul nostru, șase din 12 perechi de donatori - beneficiari cu pacienți de sex masculin și donatori de sex feminin - au prezentat eșecul grefei. Asocierea dintre nepotrivirea de gen și non-ingrafting a abordat semnificația statistică cu o valoare P de 0,07. Alți autori au găsit o asociere între eșecul grefei și nepotrivirea de gen în transplanturile de TCD, 23, 24, dar asocierea a fost mai pronunțată la pacienții cu donatori masculini. În mod similar, un studiu BMT pentru anemia aplastică severă efectuat la această instituție a constatat un risc crescut de respingere atunci când pacienții au primit măduvă osoasă de la donatori de sex masculin. 25 Un raport al Grupului european pentru transplantul de sânge și măduvă osoasă privind transplanturile de donatori fără legătură pentru anemia Fanconi 26 a constatat o incidență mai mare a eșecului primar al grefei la donatorii de sex feminin, dar această constatare a fost atribuită numărului scăzut de celule femele de grefă osoasă. Acest lucru nu a fost cazul la pacienții și donatorii noștri cu insuficiență a grefei.

Infecția virală poate fi asociată cu eșecul grefei și un pacient cu SCID a documentat gripa A dintr-o cultură de spută obținută la o zi după transplant. Doi din cei trei pacienți care au fost supuși pre-transplantului cu doze mari de condiționare a citoxanului au dezvoltat hematurie pozitivă la virusul BK, dar nu există nicio asociere între infecția cu virusul BK și eșecul grefei. Antigenul CMV precoce a fost detectat la un pacient cu ALD cu o lună înainte de respingerea grefei și a fost tratat în mod adecvat cu ganciclovir fără dezvoltarea citopeniei sau a bolii CMV.

Eșecul grefei în talasemie este un risc bine descris, cu incidența variind de la 7% la pacienții din clasa 1 și clasa 2 până la 22% din pacienții din clasa 3. 27, 28, 29, 30 Deși numărul de pacienți talasemici supuși BMT din seria noastră este prea mic pentru a obține semnificație statistică, incidența eșecului grefei la trei din patru pacienți este importantă din punct de vedere clinic și mult mai mare decât se credea anterior în literatura actuală . În plus, toți cei trei pacienți cu talasemie care au prezentat eșecul grefei au fost încadrați în clasa 1 și, prin urmare, au avut un risc preconizat de eșec al grefei de numai 7%. Interesant este că un pacient din seria noastră care a obținut aderență permanentă a fost repartizat la clasa 3.

Folosind CCE pentru epuizarea transplantului de măduvă osoasă a celulelor T și citometria în flux pentru salvarea celulelor stem CD34 + din fracția bogată în limfocite, am reușit să obținem aderența rapidă a măduvei osoase a donatorului, menținând în același timp rate scăzute de GVHD clinic sever. Această metodă de manipulare a grefei a dus la o reducere de 200 de ori a celulelor T în comparație cu recolta de pre-tratament și la o creștere de 2 ori a celulelor stem CD34 + comparativ cu fracțiile de rotor eluate. Adăugarea de celule stem CD34 + la alogrefă a împiedicat grefa întârziată observată cu măduvă elutriată unică. Pacienții noștri au prezentat un timp mediu până la neutrofile (ANC> 500) și trombocite (> 20.000 fără transfuzie timp de 7 zile) la 16 zile și 25 de zile. Aceste rezultate sunt similare cu cele descrise de O'Donnell și colab. 15 la pacienții adulți cărora li s-au efectuat transplanturi de frate corespunzătoare cu alogrefe pregătite în mod similar.

Incidența GVHD semnificativă clinic (19%) observată în acest studiu a fost scăzută. La pacienții cărora li s-au efectuat BMT fără legătură cu HLA, rata GVHD semnificativă clinic a depășit 75% la grefele netratate și la profilaxia CSA/metotrexat. Deși este de dorit un anumit grad de GVHD datorită efectului său asociat grefei versus leucemie, titrarea precisă a GVHD este dificilă. Prin urmare, GVHD rămâne o cauză majoră de morbiditate și mortalitate la transplanturile fără legătură. În această instituție, utilizarea unui TCD simplu a redus incidența GVHD semnificativ clinic sub 25%. Cu toate acestea, TCD simplă a fost asociată cu o incidență mai mare (10%) a eșecului grefei și, prin urmare, nu a dus la o îmbunătățire generală a supraviețuirii. Utilizarea concomitentă a augmentării CD34 + cu elutriere ne-a permis să obținem o aderență rapidă și susținută, menținând în același timp rate scăzute de GVHD sever. Într-un studiu paralel la pacienți adulți cărora li s-au efectuat transplanturi adecvate de frați, O'Donnell și colab. Au raportat doar 11% din GVHD semnificative clinic. Aceste rezultate sunt în concordanță cu rata de 19% observată la pacienții copii și adolescenți care au fost supuși transplanturilor conexe și fără legătură. Ambele experiențe reprezintă o îmbunătățire semnificativă față de grefa BMT nemanipulată.

În acest studiu pe 54 de pacienți copii și adolescenți, TCD cu creșterea CD34 + a dus la aderență rapidă și niveluri scăzute de GVHD semnificativ clinic la pacienții cu afecțiuni maligne hematologice. Cu toate acestea, la pacienții cu boli benigne, un subgrup de pacienți la care prevenirea GVHD este cea mai de dorit, deoarece nu are niciun beneficiu asociat de grefă versus leucemie, această tehnică de manipulare a grefei a fost asociată cu un risc semnificativ de eșec al grefei. Explicațiile posibile pentru această constatare includ o imunitate mai intactă în comparație cu pacienții cu leucemie puternic pretratați și aloimunizarea din transfuzii multiple de globule roșii. La copiii cu boli benigne, va fi necesar să se reducă riscul de respingere a grefei prin creșterea ablației imune cu un regim preparativ și/sau îmbunătățirea supresiei imune după transplant. Scopul acestor modificări este menținerea beneficiilor CDCD + de mărire a TCD, inclusiv timpul rapid al grefei și incidența scăzută a GVHD, reducând totodată riscul de eșec al grefei.