șoareci

  • abstract
  • INTRODUCERE
  • MATERIALE ȘI METODE
  • obiecte
  • droguri
  • Test de înot forțat
  • Testul suspensiei cozii
  • Test de câmp deschis
  • Test explorator luminos-întunecat
  • Test de urgență
  • EPM
  • Măsurarea hormonului stresului
  • analize statistice
  • REZULTATELE
  • Scăderea comportamentului asemănător depresiei la șoarecii cu deficit de GAT1
  • Scăderea comportamentului asemănător anxietății la șoarecii knockout GAT1
  • Măsurarea hormonului stresului
  • DISCUŢIE

abstract

Depresia și anxietatea afectează milioane de oameni de toate vârstele, rasele, religiile și veniturile. Cu toate acestea, baza moleculară pentru dezvoltarea acestor tulburări rămâne în mare parte necunoscută. Dovezi în creștere sugerează că sistemul acidului γ-aminobutiric (GABA) este important în patogeneza bolilor psihologice, inclusiv anxietatea și depresia. Studiile care utilizează spectroscopia prin rezonanță magnetică sugerează că depresia unipolară este asociată cu scăderea nivelului cortical de GABA. Tratamentele antidepresive și stabilizatoare ale dispoziției par, de asemenea, să crească nivelul cortical de GABA și să îmbunătățească deficitele de GABA la pacienții cu tulburări de dispoziție (Krystal și colab., 2002). Receptorii GABA, inclusiv receptorii GABA A și GABA B, sunt în general considerați ținte pentru tratamentul bolilor mintale (Kalueff și Nutt, 1996). Cu toate acestea, medicamentele utilizate pentru un astfel de tratament au efecte secundare (Johnston, 1996; Tsang și Xue, 2004). Studiile la animale cu inhibitori ai absorbției GABA au arătat efecte anxiolitice semnificative, sugerând că modularea absorbției GABA ar putea fi o țintă potențială pentru tratamentul tulburărilor mentale (Sayin și colab., 1992; Schmitt și Hiemke, 1999).

MATERIALE ȘI METODE

obiecte

droguri

Amitriptilina, imipramina, fluoxetina și buspirona au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich. Tiagabine a fost un cadou amabil de la Centrul de Cercetare Celstar pentru Biotehnologie din Shanghai. Diazepamul a fost achiziționat de la Shanghai Jiufu Pharmaceutical Co., Ltd. Aceste medicamente au fost dizolvate în soluție salină înainte de administrare.

Test de înot forțat

Șoarecii au fost așezați într-un cilindru de plexiglas (10 cm diametru interior, 50 cm înălțime) umplut cu apă de 25-26 ° C (10 cm înălțime). Comportamentul animalelor a fost evaluat manual și timpul de imobilitate a fost măsurat în timpul a 5 minute de experimentare. Șoarecele a fost considerat imobil atunci când a rămas plutind în apă, ceea ce necesită doar mișcările necesare pentru a-și menține capul deasupra apei (Bilkei-Gorzo și colab., 2002; Porsolt și colab., 1977a).

Testul suspensiei cozii

Animalele au fost injectate intraperitoneal cu un volum de 10 ml/kg vehicul (ser fiziologic) sau antidepresiv. Amitriptilina (10 mg/kg), imipramina (5 mg/kg) și fluoxetina (20 mg/kg) au fost utilizate ca antidepresive. Patruzeci de minute mai târziu, șoarecele a fost agățat individual de o coadă de o tijă metalică. Lanseta a fost atașată la 50 cm deasupra suprafeței mesei acoperită cu o cârpă moale într-o cameră securizată împotriva zgomotului. Vârful cozii mouse-ului a fost atașat la tijă cu bandă adezivă scoțiană. Durata testului a fost de 5 minute. Timpul de imobilitate al șoarecilor atârnați la coadă a fost măsurat așa cum s-a descris anterior (Bilkei-Gorzo și colab., 2002; Steru și colab., 1985).

Test de câmp deschis

Testul în câmp deschis a fost efectuat în conformitate cu rapoartele publicate (Holmes și colab., 2003a, 2003b; Mathis și colab., 1994). Câmpul deschis era o arenă pătrată (50 × 50 × 50 cm3) cu pereți transparenți și podea din plexiglas, luminată puternic de plafonul fluorescent (1,5 μmol/m2/s). Șoarecii au fost așezați în centrul cutiei și au fost lăsați să examineze liber timp de 10 minute. Șoarecii au fost capturați folosind o cameră video montată deasupra podelei și analizați utilizând un sistem de supraveghere video (Morris stray analyzer, V 1.1 folosind BGB). „Marginea” definită a arenei are o lățime de 8 cm de-a lungul peretelui, iar câmpul „mijlociu” este definit ca aria medie de 20 × 20 cm 2 a câmpului deschis, aproximativ 16% din suprafața totală.

Test explorator luminos-întunecat

Screening-ul întunecat a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (Crawley, 1981; Holmes și colab., 2003a, 2003b). Aparatul consta dintr-o cușcă din polipropilenă (32 × 16 × 16 cm 3) împărțită în două compartimente (întunecate și deschise) printr-o partiție cu o mică deschidere (8 × 5 cm 2) la nivelul pardoselii și echipată cu un senzor infraroșu folosit pentru a monitoriza numărul de pasaje și timpul petrecut în fiecare cameră pentru fiecare mouse. În timpul acestor experimente, luminile de tavan au fost stinse. Jumătatea ușoară a cutiei pendulului era deschisă, transparentă și iluminată de o lampă de masă (100 W). Șoarecii au fost așezați individual în centrul compartimentului de lumină cu fața îndepărtată de sept și li s-a permis să examineze instrumentul liber timp de 5 minute. Au fost înregistrate numărul de tranziții lumină - întuneric între cele două compartimente și timpul total petrecut în compartimentul întunecat.

Test de urgență

Testul de urgență a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (Holmes și colab., 2003b; Smith și colab., 1998; Takahashi și colab., 1989). Dispozitivul consta dintr-un cub de plexiglas negru opac (16 × 16 × 19 cm3) cu o priză (6 × 4 cm2) pe o parte la nivelul podelei. Acest „adăpost” a fost plasat într-un câmp deschis (50 × 50 × 50 cm3), luminat puternic de o plafon fluorescent, cu o priză orientată spre câmp deschis (paralel cu un perete al câmpului deschis). Șoarecii au fost plasați mai întâi într-un adăpost pentru o obișnuință de ieșire închisă de 5 minute. Deschiderea a fost apoi deschisă pentru a permite șoarecilor să părăsească adăpostul și să examineze câmpul deschis timp de 5 minute. Pentru fiecare șoarece, latența să apară din adăpost, timpul petrecut în afara adăpostului și tranzițiile către spațiul deschis au fost înregistrate.

EPM a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (File, 2001; Holmes și colab., 2003a; Lister, 1987). Aparatul consta din două brațe deschise (25 × 8 cm2) și două brațe închise (25 × 8 × 12 cm3) care se extind de pe o platformă centrală comună (8 × 8 cm2). Penele mici ridicate (0,5 cm) în jurul marginilor brațelor deschise au împiedicat alunecarea animalelor. Dispozitivul a fost construit din polipropilenă și plexiglas (podea albă, pereți transparenți) și ridicat la o înălțime de 50 cm deasupra podelei. Șoarecii au fost obișnuiți în sala de testare cu 2 zile înainte de test și pre-tratați cu atenție de două ori pe zi pentru a ameliora nervozitatea. Pentru experimentele de tratament medicamentos, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 10 ml/kg vehicul (soluție salină) sau medicamente, buspironă (1 mg/kg), diazepam (1 mg/kg) și tiagabină (8 mg/kg), cu 40 de minute înainte de test. EPM. Șoarecii au fost așezați individual pe un pătrat central orientat spre brațul deschis și li s-a permis să examineze instrumentul liber sub lumină uniformă (1,5 μmol/m 2/s) timp de 10 minute. Șoarecii au fost capturați folosind o cameră video montată deasupra labirintului și analizați utilizând un sistem de supraveghere video (Morris stray analyzer. În 1.1 folosind BGB). Brațele deschise și închise (toate cele patru labele din umăr) au fost observate de un observator cu experiență.

Măsurarea hormonului stresului

Sângele a fost colectat de la șoareci decapitați după sângerare imediat după 10 minute de reținere fizică (15 minute de reținere într-un tub conic de 50 ml) sau din repaus într-o cușcă de acasă (0900-1000) și centrifugat printr-un tub de colectare a serului la 1000 g timp de 15 min. și stocate la -20 ° C. până la utilizare. Măsurătorile corticosteronului au fost efectuate pe ser folosind un test imunologic cu corticosteron (sisteme R&D) conform instrucțiunilor producătorului.

analize statistice

Valorile medii și SE au fost calculate pentru fiecare grup și grupurile au fost comparate utilizând ANOVA unidirecțional, urmată de testul t. p +/+, n +/- și n -/- .

REZULTATELE

Scăderea comportamentului asemănător depresiei la șoarecii cu deficit de GAT1

În acest studiu, un test de înot forțat (Porsolt și colab., 1977a, 1977b) și un test de suspensie a cozii (Bilkei-Gorzo și colab., 2002; Steru și colab., 1985) au fost utilizate pentru a evalua tendința către comportamentul depresiv grupuri genotipic diferite de șoareci. Ambele scheme experimentale se bazează pe observația că, atunci când rozătoarele sunt forțate să intre într-o situație aversivă din care nu pot scăpa, încetează să încerce să scape și devin imobile. Antidepresivele reduc timpul de imobilitate în aceste teste (Porsolt, 2000; Steru și colab., 1987), sugerând că aceste metode pot fi utilizate pentru a testa comportamentul legat de depresie la șoareci. În testul de înot forțat, așa cum se arată în Figura 1a, timpul de imobilitate pentru șoarecii GAT1 -/- a fost semnificativ mai mic decât timpul pentru animalele GAT1 +/- și GAT1 +/+ (F (2, 33) = 63, p -/- comparativ cu șoarecii GAT1 +/+ (F (2, 16) = 16, p +/+ și GAT1 +/−, dar nu la șoarecii GAT1 -/-. Cu toate acestea, un răspuns similar la un alt inhibitor de absorbție triciclic, imipramina, în toate cele trei grupuri (Figura 1b) Aceste constatări sugerează că modificările pe termen lung ale homeostaziei GABAergice afectează tendința comportamentală dependentă de depresie a șoarecilor cu o posibilă implicare a sistemului serotoninergic.

Șoarecii GAT1 -/- au prezentat un comportament redus asemănător depresiei în testul de înot forțat și testul suspensiei cozii. a) Test de înot forțat (n = 12 pe grupă). Comportamentul șoarecilor diferiți din punct de vedere genotipic a fost măsurat în timpul unui test de înot forțat de 5 minute. Timpul de imobilitate la șoareci sălbatici, heterozigoți și homozigoti a fost de 159,4 ± 8,7 s; 98, 3 ± 7, 6 s; 13, 6 ± 5, 1 s. *** p +/+ = 6, n +/− = 7, n -/- = 6) sau 10 mg/kg amitriptilină (n +/+ = 7, n +/− = 6, n -/- = 8) sau 5 mg/kg imipramină (n +/+ = 7, n +/− = 6, n -/- = 8) sau 20 mg/kg fluoxetină (n +/+ = 5, n +/− = 5, n -/- = 5) așa cum este descris în Materiale și metode. Timpul de imobilitate a fost măsurat în timpul unui test de suspendare a cozii de 5 minute. ## p ### p * p ** p *** p -/- a petrecut mai mult timp în zona centrală și a făcut mai multe intrări (F (2, 51) = 3, 79, p = 0, 029) decât alți doi șoareci genotipici. Între timp, șoarecii GAT1 -/- au prezentat hiperactivitate și motilitate crescută. Acest fenotip s-a manifestat ca o creștere semnificativă a timpului de schimbare (F (2, 51) = 26, 3, p -/-. A existat, de asemenea, un număr semnificativ mai mare de aberații la șoarecii GAT1 -/- (F (2, 51) = 7, 63, p = 0,002).

Tabel în dimensiune completă

Deoarece rezultatele experimentelor pe teren liber sugerează că eliminarea GAT1 duce la un comportament redus de anxietate similară, am decis să confirmăm aceste observații cu teste suplimentare.

Paradigma sondajului lumină-întuneric, care se bazează pe aversiunea înnăscută a rozătoarelor față de zonele puternic luminate și pe comportamentul explorator spontan al animalelor, este utilizată în primul rând pentru a detecta comportamentul anxiogen (Hascoet și colab., 2001). Șoarecii GAT1 -/- au petrecut mult mai puțin timp în camera întunecată decât șoarecii de tip sălbatic (F (2, 43) = 8,38, p

Șoarecii GAT1 -/- au prezentat un comportament redus asemănător anxietății în testele de screening și detectare cu lumină și întuneric. a) În testul lumină-întuneric (n +/+ = 17, n +/− = 15, n -/- = 14). Șoarecii GAT1 -/- au efectuat mai multe tranziții lumină-întuneric. b) Șoarecii GAT1 -/- au petrecut mai puțin timp în compartimentul întunecat decât șoarecii GAT1 +/+. c) În testul de formare (n +/+ = 6, n +/− = 8, n -/- = 7). Șoarecii GAT1 -/- protejează mai bine tranzițiile în câmp deschis. (d) Șoarecii GAT1 -/- au petrecut mai mult timp în afara adăpostului decât șoarecii GAT1 +/+. e) Prima dată când părăsim adăpostul șoarecilor GAT1 -/-, este mai lung decât la șoarecii GAT1 +/+, dar diferența nu este semnificativă. ** p *** p +/- șoareci.

Imagine la dimensiune completă

Rezultatele testului de urgență sunt prezentate în Figura 2c-e. A existat un efect genotipic semnificativ asupra tranzițiilor în câmp deschis și a timpului procentual petrecut în afara adăpostului, dar nu și asupra latenței care a părăsit inițial adăpostul (F (2, 18) = 0,45, p = 0,65). Analiza ANOVA unidirecțională a arătat că șoarecii GAT1 -/- au făcut tranziții de câmp mai deschise (F (2, 18) = 6,52, p = 0,007) și au petrecut mai mult timp în afara incintei (F (2, 18) = 10, 9 ), p -/- a petrecut mai mult timp în brațul deschis (F (2, 35) = 42, dar șoarecii p -/- au avut mai puțin efect asupra comportamentului său în testul crescut plus labirint (Figura 3).

Nivelurile de corticosteron normale și induse de stres în serul șoarecilor GAT1 -/-. Șoarecii GAT1 +/+ și GAT1 -/- au fost eliminați din cușca de acasă (naivi) sau expuși la stres fizic de reținere timp de 10 minute. Sângele a fost colectat de la șoareci prin sângerări decapitate imediate (n +/+ = 5, n +/− = 5, n -/- = 5). Barele și coloanele reprezintă media ± SEM. ** p +/- șoareci.

Imagine la dimensiune completă

DISCUŢIE

GABA este cel mai important neurotransmițător inhibitor din sistemul nervos central (SNC), iar sistemele GABAergic joacă un rol important în fiziopatologia depresiei și anxietății. Spectroscopia prin rezonanță magnetică a fost observată că depresia unipolară este asociată cu scăderea nivelului cortical de GABA la pacienți (Krystal și colab., 2002). În plus, tiagabina, un inhibitor GAT1, este utilizată pentru tratarea tulburărilor de anxietate (Crane, 2003; Lydiard, 2003; Schaller și colab., 2004; Schmitt și Hiemke, 1999). Aceste observații oferă o justificare pentru examinarea schimbărilor în comportamentul stării de spirit la GAT1 -/șoareci. - .

Testele de înot forțat și suspensiile de coadă sunt cele mai utilizate modele animale pentru screeningul antidepresiv. Imobilitatea, o atitudine care reflectă o stare de „disperare comportamentală” în care animalele nu mai scapă, este asociată cu depresia, iar medicamentele antidepresive scurtează timpul în care animalele sunt imobile (Bilkei-Gorzo și colab., 2002; Borsini și colab. și colab., 1988; Porsolt și colab., 1977a). În studiul nostru actual, am găsit un timp de imobilitate redus semnificativ pentru șoarecii GAT1 -/- în ambele teste. Aceste efecte comportamentale sunt similare cu cele observate de noi și de alți cercetători la animale de tip sălbatic tratate cu antidepresive precum amitriptilină, imipramină și fluoxetină (Figura 1b) (Bilkei-Gorzo și colab., 2002; Borsini și colab., 1988) . Porsolt și colab., 1977a).

Pentru a investiga în continuare rolul GAT1 în comportamentul de anxietate, au fost selectate trei medicamente anxiolitice: buspirona, diazepamul, tiagabina, care au ținte moleculare diferite, pentru a studia efectul lor asupra șoarecilor mutați GAT1 utilizând modelul de comportament EPM. Diazepamul și tiagabina acționează asupra sistemului GABAergic. Diazepamul este un agonist la siturile BDZ pentru a crește curentul C1 al GABA A și este o benzodiazepină cu proprietăți de scădere a SNC (Banfi și colab, 1982; Atack, 2005). Clorhidratul de tiagabină, un inhibitor selectiv al recaptării GABA, crește tonusul GABA prin blocarea GAT1 (Nielsen și colab., 1991; Rekling și colab., 1990). Buspirona, un agonist parțial al receptorului serotoninei 1A, are, de asemenea, un efect antagonist asupra receptorilor D (2) -dopaminici și α2-adrenergici (Gobert și colab., 1999). Tratamentul de tip sălbatic cu aceste medicamente a crescut semnificativ activitatea în brațele deschise ale testului EPM. Cu toate acestea, șoarecii fără GAT1 -/- nu au fost sensibili la efectele comportamentale ale acestor medicamente.

Mulți pacienți cu episoade depresive majore au dereglat controlul circadian al cortizolului cu niveluri semnificativ mai mari în sânge decât persoanele sănătoase (Strickland și colab., 2002; Urani și colab., 2005). Nivelurile crescute de cortizol la pacienții cu depresie revin de obicei la normal după un tratament antidepresiv de succes (Wolkowitz și colab., 1993, 1999). Studiile anterioare au arătat că benzodiazepinele clasice reduc activitatea cortexului cortical al HPA (Mikkelsen și colab., 2005) și nivelurile scăzute de corticosteron pot fi asociate cu anxietate redusă (Ferguson și colab., 2004; Smith și colab., 1998) . Am examinat funcția axei HPA la șoarecii GAT1 -/- prin măsurarea nivelurilor de corticosteron după stresul de reținere fizică și în timpul activității normale. Nivelurile de corticosteron au fost mai mici la șoarecii GAT1 -/- decât la șoarecii de tip sălbatic în timpul activității normale. Cu toate acestea, nu au existat diferențe între genotipurile stresate. Acest lucru sugerează că funcția axei HPA la șoarecii GAT1 -/- a fost modificată în condiții normale, dar sensibilitatea sa la stres nu poate fi modificată.

În cele din urmă, rezultatele noastre susțin ipoteza că reglarea funcției GAT1 afectează comportamentul asemănător anxietății și depresiei. Pe baza observațiilor noastre la șoarecii GAT1 -/- și GAT1 +/− în absența și exprimarea scăzută a GAT-1, datele noastre oferă informații despre contribuția expresiei GAT1 la manifestarea acestor tulburări mentale. Prin urmare, medicamentele care pot regla funcția sau expresia GAT1 cu modularea ulterioară a sistemului GABAergic pot avea valoare terapeutică în tratamentul acestor boli mintale. Șoarecii GAT1 -/- pot oferi un instrument util pentru a defini în continuare efectele farmacologice ale antidepresivelor și anxioliticelor și farmacogenetica depresiei și anxietății.