obiecte

abstract

Finalizarea proiectului genomului uman și dezvoltarea screeningului la nivelul genomului au făcut din tehnologia microarray un instrument important pentru studierea efectelor genetice asupra etiologiei tulburărilor psihiatrice 7. Studiile anterioare au descoperit că genele din sânge și țesuturile creierului au modele similare de exprimare de 8, 9 și este mai ușor să măsoare expresia genelor în sânge, deoarece poate fi obținută cu o invazivitate minimă. Abordările microarray au fost utilizate pe scară largă pentru a investiga tulburările neuropsihiatrice, cum ar fi schizofrenia 10, tulburarea bipolară 11 și tulburarea depresivă majoră (MDD) 12. În plus, datele microarray au fost utilizate pentru a găsi noi gene și căi care ar putea fi legate de etiologia tulburărilor psihiatrice. Cu toate acestea, din cunoștințele noastre, microarrays nu au fost utilizate pentru a examina expresia genelor în sângele periferic al pacienților cu TOC. În acest studiu, ne-am concentrat pe detectarea genelor (ARNm) care au fost exprimate diferențial între pacienții cu TOC și controalele sănătoase utilizând tehnologia microarray. De asemenea, am efectuat o analiză a îmbogățirii enciclopediei genologice ontologice (GO) și Kyoto a genelor și genomelor (KEGG) asociate cu genele pentru a examina funcțiile mARN-urilor exprimate diferențial.

Rezultatul

ARNm exprimat diferit

Am folosit microarrays pentru a scana genomic ARNm din celule mononucleare din sânge periferic (PBMC) a 30 de pacienți cu TOC și 30 de controale sănătoase asociate.

Am găsit un total de 51 de mARN-uri exprimate diferențial, cu o schimbare de ori ≥ 1, 5 și o frecvență a falsilor pozitivi

expresiei

Graficul vulcanic al modificărilor profilurilor de expresie genică ale întregului genom al celulelor mononucleare din sângele periferic între pacienții cu TOC și controale sănătoase. S-au găsit un total de 51 de ARNm exprimate diferențial semnificativ, cu o schimbare de pli de ≥1,5 și o valoare p ajustată de Bonferroni

Heatmap top 100 de gene exprimate diferențial, care pot distinge pacienții cu TOC și controalele sănătoase obținute prin analiza ierarhică a clusterului.

Imagine la dimensiune completă

Adnotare funcțională

Analiza îmbogățirii funcționale GO a arătat că 23 din 51 de mARN-uri exprimate diferențial în mod semnificativ au fost îmbogățite în termeni de proteină ribozomală, incluzând procesul metabolic al proteinelor celulare, dezvoltarea pancreatică endocrină, transcrierea virală, ciclul infecției virale, reproducerea virală, expresia genelor, traducerea ARN și traducerea . Genele care codifică NDUFA4 (NADH dehidrogenază (ubiquinonă) 1alpha subcomplex), NDUFA5 și NDUFA1 s-au îmbogățit semnificativ în transferul de electroni mitocondriali și NADH la ubiquinonă, iar genele care codifică NDUFA4, COX7C (citocrom caz) transportul hidrogenului.

Analiza benzii KEGG 51 a mARN-urilor exprimate semnificativ diferențial a identificat, de asemenea, 23 de mARN-uri care au fost îmbogățite pentru un ribozom; NDUFA4, NDUFA5, COX7C, NDUFA1 și UQCRB, care s-au îmbogățit semnificativ în boala Parkinson, boala Alzheimer, boala Huntington și boala hepatică grasă nealcoolică și COX7C, CACNB4 (canalul calciului, subunitatea dependentă de tensiune, subunitatea beta 4), beta 4 subunități s-au îmbogățit semnificativ prin contracția mușchiului cardiac (Tabelul 2).

Tabel în dimensiune completă

Validare PCR în timp real (qRT-PCR)

Pentru a verifica rezultatele analizei microarray, am selectat 10 transcrieri de mARN exprimate diferențial pentru validare prin qRT-PCR, și anume RPS3A, RPL34, RPS24, RPL23, RPS7, RPL41, RPL7, RPL26, ZNF721 și COMMD6. Rezultatele qRT-PCR au arătat că RPL34 a fost reglat în jos în conformitate cu analiza microarray, în timp ce RPS3A, RPS24, RPL23, RPS7, RPL41, RPL7 și RPL26 au fost reglate în sus (Tabelul 3). ZNF721 și COMMD6 nu s-au dovedit a fi exprimate diferențial între TOC și controalele sănătoase prin qRT-PCR (Tabelul 3).

Tabel în dimensiune completă

discuţie

Din câte știm, acesta este primul studiu care a dezvăluit gene exprimate diferențial între pacienții cu TOC și controale sănătoase folosind tehnologia ARNm microarray. Am găsit 45 de mARN-uri care au fost reglate în jos și 6 mARN-uri care au fost reglate în sus la pacienții cu TOC.

Studiile anterioare au arătat că gene importante implicate în fiziopatologia TOC au fost asociate cu sistemele de serotonină, dopamină și glutamat 13, 14, 15; cu toate acestea, nu am detectat aceste gene în acest studiu. Aceste diferențe pot fi explicate prin diferitele metode de cercetare care au fost utilizate. În studiile anterioare, abordările genice candidate 13, 14, 15 au fost utilizate pentru a investiga genele legate de TOC, în timp ce microarrays au fost folosite pentru a detecta genele legate de TOC 16. Analizele GO și KEGG au dezvăluit 23 de mARN-uri exprimate diferențial, care au fost îmbogățite pentru termenii și căile legate de proteina ribozomală (RP).

Ribozomii sunt organite subcelulare compuse din două subunități diferite 17 și fiecare subunitate conține un număr diferit de ARN ribozomali (ARNr) și RP. Subunitățile mari ribosomale 60S se asamblează cu subunități mici 40S pentru a forma ribozomi 80S. La mamifere, complexul de nucleoproteine ​​ribozomale 80S conține 4 ARNr și aproximativ 80 de proteine, cu peste 150 de proteine ​​asociate și aproximativ 70 de ARN-uri nucleare mici 18. Subunitatea mică 40S mediază interacțiunile dintre ARNt și ARNm și selectează ARNt corect pentru centrul de decodare. Subunitatea mare 60S conține un centru de peptidil transferază și oferă un tunel de ieșire pentru lanțul polipeptidic în curs de dezvoltare. Funcția ribozomilor în traducerea ARNm în proteine ​​și în traducere depinde ferm de proteinele ribozomului (RP) 19. RP sunt foarte conservate, astfel încât deficiențele cantitative duc la sinteza proteinelor reduse 20, care poate afecta o varietate de procese patologice, cum ar fi cancerul 21, bolile genetice 22 și infecția virală 23. .

Membrii familiei proteinei degetului de zinc (ZNF) au motive de legare a ADN-ului și ARN-ului, iar aminoacizii sunt asamblați într-o singură unitate structurală în jurul atomului de zinc 32. Proteinele ZNF au o gamă largă de funcții, inclusiv transcrierea și recunoașterea ADN-ului 33. ZNF804A a fost identificat ca una dintre cele mai proeminente gene de risc asociate cu tulburări psihiatrice 34, 35. În acest studiu, am constatat că mARN-ul ZNF721 a fost redus la pacienții cu TOC.

Proteinele COMMD (domeniul metabolismului cuprului) care conțin proteine ​​(cunoscute și sub denumirea de MURR1) au fost descoperite în urmă cu aproximativ 10 ani, iar 10 proteine ​​COMMD sunt cunoscute până în prezent. De exemplu, acestea sunt implicate în homeostazia cuprului, reglarea factorului de transcripție NF-κB (factor nuclear κB) și proliferarea celulară 36. COMMD6, o proteină solubilă mică exprimată omniprezent și inhibitor endogen NF-κB, leagă ADN-ul și activează transcrierea 37, 38. Activarea NF-κB a fost asociată cu unele boli neurodegenerative ca o consecință a rolului neurotoxic al NF-κB 39. Reglarea descendentă a COMMD6 sau tratamentul cu un alt inhibitor NF-κB NFκBIA poate crește activarea NF-κB, ceea ce poate afecta funcția hipocampului la persoanele cu TOC.

Subunitatea NADH dehidrogenază (ubiquinonă) 1 subcomplex alfa (NDUFA4) este a 14-a subunitate a citocrom c oxidazei. NDUFA4L2 inhibă complexul I de fosforilare oxidativă, complexul de oxigen final care primește complexul enzimatic al lanțului respirator mitocondrial, pentru a media trecerea la glicoliză în celulele în creștere și țesuturile canceroase 40. Expresia excesivă a NDUFA4 observată în celulele canceroase pulmonare este în contrast cu reglarea descendentă a acesteia în boala Alzheimer. Un studiu anterior al genomului întreg a constatat că NDUFA4 este asociat cu boala Alzheimer și a fost identificat ca un potențial biomarker al bolii 41. Proteina de legare a citocromului c ubiquinol reductazei (UQCRB) este importantă pentru stabilitatea complexului mitocondrial III, transportul electronilor, detectarea oxigenului celular și angiogeneza. NDUFA, COX7C și UQCRB sunt implicate în lanțul respirator mitocondrial și toate cele trei au fost reduse la pacienții cu TOC. Cu toate acestea, există cunoștințe limitate despre relația dintre disfuncția mitocondrială și TOC.

Genele care codifică receptorii de tip 2 cu gust fierbinte (TAS2R30 și TAS2R46) au fost supuse reglării în TOC. TAS2Rs sunt exprimate pe scară largă în afara creierului, dar relația lor cu TOC este necunoscută.

CACNB4 este una dintre subunitățile de canal beta cu tensiune închisă, care s-a dovedit recent că funcționează în excitabilitatea neuronală și transcrierea genei 42. CACNB4 a fost supraexprimat în schizofrenie și a fost asociat cu depresia curenților de calciu care controlează formarea și stabilizarea măduvei spinării, iar expresia crescută a CACNB4 a dus la pierderea scăzută a coloanei vertebrale 43. Se presupune că reglarea ascendentă a CACNB4 găsită în studiul nostru poate fi legată de patogeneza TOC.

Câteva limitări trebuie menționate în studiul nostru. În primul rând, dimensiunea eșantionului a fost relativ mică, ceea ce ar putea reduce puterea statistică de comparare a expresiei genice între TOC și controalele sănătoase. Au existat discrepanțe în direcția modificărilor genetice între analiza microarray și validarea qRT-PCR, probabil pentru că s-au folosit probe diferite pentru validare, iar pacienții se aflau în stadii diferite ale tulburării și în regimuri de tratament diferite.

În cele din urmă, am găsit modele modificate de exprimare a genelor la pacienții cu TOC și am subliniat rolul genelor RP în patogeneza TOC.

Materiale și metode

Profiluri de participanți

Acest studiu a fost efectuat la Centrul de Sănătate Mentală Wuxi de la Nanjing Medical University, Wuxi, provincia Jiangsu, China. Au fost admiși 30 de pacienți cu TOC și 30 de controale sănătoase din punct de vedere sexual și vârstnic. Au fost 20 de bărbați și 10 femei în ambele grupuri. Vârsta medie a fost de 28,8 ± 12,0 ani (interval 15-60 ani) și 28,8 ± 11,1 ani (interval 17-56 ani) pentru pacient și grupul de control. Diagnosticul TOC a fost confirmat de un interviu clinic structurat pentru tulburările DSM-IV (SCID). Au fost excluși pacienții cu schizofrenie, MDD, tulburare de axă comorbidă I sau antecedente de boli neurologice. Verificările sănătoase, care nu aveau boli psihiatrice sau sănătate gravă, au fost primite de la comunitatea locală.

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică Umană al Centrului de Sănătate Mentală Wuxi de la Nanjing Medical University. Fiecare participant a furnizat consimțământul scris în scris. Toate procedurile de studiu au fost în conformitate cu Declarația de la Helsinki din 1975.

Prelevarea de sânge și izolarea PBMC

Sângele periferic a fost colectat în tuburi vacutainer de 10 ml conținând EDTA și stocat imediat la 4 ° C. Sângele întreg a fost procesat în decurs de 2 ore de la colectare.

Centrifugarea cu gradient de densitate Ficoll a fost utilizată pentru a separa celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC). Pe scurt, sângele diluat cu soluție salină a fost stratificat prin Ficoll, apoi centrifugat pentru a separa celulele roșii din sânge, PBMC și plasmă. PBMC-urile au fost aspirate ușor și complet din stratul Ficoll și transferate într-un tub nou, care a fost spălat de două ori.

Izolarea ARN-ului total

ARN-ul total a fost extras din PBMC folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, SUA) conform instrucțiunilor producătorului și cuantificat utilizând NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific). Integritatea ARN (RIN) a fost evaluată folosind un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).

RIN mediu (SD) pentru toate probele a fost de 9,29 (0,48). Raportul dintre 28S și 18S ARNr a fost de 2,79 (0,35), iar RIN a fost ≥7. Pentru 28S: 18S, o valoare RIN> 0,7 a fost considerată a fi în cadrul calității acceptabile a ARN în conformitate cu instrucțiunile producătorului.

microarray de mARN, etichetare, hibridizare și scanare

ARN-ul total a fost marcat cu mARN complet și kit Hyb (Agilent Technologies) și hibridizat cu lncRNA uman Microarray 4, 04 x 180 K (Agilent Technologies). Microcipul conține 30.656 de sonde pentru ARNm uman, toate derivate din baze de date autorizate, inclusiv RefSeq Build, Ensemble Release, GenBank și Unigene Build. ARN total (200 ng fiecare) a fost transcris invers în ADNc dublu catenar, apoi sintetizat în ARNc și a fost desemnat cianină-3-CTP. ARNc-urile marcate au fost hibridizate la un microarray. După spălare, cipurile au fost scanate folosind un scaner Agilent Microarray (G2505C, Agilent Technologies).

Validare prin qRT-PCR

ARN-ul total a fost izolat din PBMC din alte 26 de perechi de TOC și controale sănătoase folosind reactiv TRIzol (Invitrogen) cu tratament pe coloană DNază I, așa cum este descris de producător. ADNc a fost sintetizat utilizând trusa de înaltă capacitate ARN-la-ADNc (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului. QRT-PCR-urile au fost efectuate folosind grundurile enumerate în Tabelul 4 și SYBR® Select Master Mix (Invitrogen) pe o mașină de PCR în timp real 7900HT (Applied Biosystems, SUA) cu următoarele cicluri: 2 minute la 50 ° C, 2 minute la 95 ° C, apoi 40 de cicluri de 15 s la 95 ° C, 60 s la 60 ° C, urmat de un protocol standard de disociere pentru a se asigura că fiecare amplicon a fost un singur produs. Toate cuantificările au fost normalizate la ACTB. QRT-PCR au fost efectuate în triplu exemplar pentru fiecare probă independentă.

Tabel în dimensiune completă

Analiza datelor

Software-ul Agilent Feature Extraction (versiunea 10.7.1.1; Agilent Technologies) a fost folosit pentru a analiza imaginile de imagine pentru a obține date brute. GeneSpring (GX v11.5.1; pachetul software Agilent Technologies) a fost utilizat pentru a analiza datele brute. Datele brute au fost normalizate mai întâi folosind un algoritm cuantil, urmat de analiza expresiei diferențiale folosind un test t student. Probele care au avut cel puțin 1 din 2 afecțiuni și au avut 75% simptome în „P” au fost selectate pentru analiza ulterioară a datelor. Genele exprimate diferențial au fost identificate pe baza modificării ori, precum și a valorii p calculate cu ajutorul testului t al elevului. Pragul stabilit pentru genele reglate în sus și în jos a fost o schimbare de ori ≥ 1, 5 și o rată de descoperire falsă ≤ 0,05.

Nivelurile de expresie MRNA între pacienții cu TOC și controalele sănătoase au fost analizate folosind testul U Mann-Whitney.

Pentru a corela mARN-urile exprimate diferențial cu procesele biologice, am adnotat mARN folosind termenii GO și căile KEGG (//www.genome.ad.jp/kegg/) pentru a determina rolurile lor potențiale. Apoi am efectuat o analiză ierarhică de grupare pentru a arăta modele distincte de exprimare a genelor între TOC și grupurile sănătoase. Cu cât valoarea lui p este mai mică, cu atât este mai semnificativă corelația; limita recomandată a valorii p a fost de 0,05.

Disponibilitatea datelor

Toate datele despre microarray au fost stocate în Omnibusul de Expresie Genică (GEO) la Centrul Național pentru Informații despre Biotehnologie NIH sub numărul de serie GSE78104.

Mulțumiri

Mulțumim sincer pacienților și voluntarilor sănătoși pentru participarea lor, precum și personalului medical implicat în colectarea probelor. Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională pentru Științe din China (81101008) și Fundația Națională pentru Științe din provincia Jiangsu (13K2012546).

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.