stabilizează

  • abstract
  • scopul:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • Materiale și metode
  • Animale și design experimental
  • Colectarea și prelucrarea țesuturilor
  • Analiza biochimică
  • Colorare histologică și imunohistochimică
  • In situ Testele dUTP mediate de TdT pentru marcarea N-terminal
  • Western blots
  • analize statistice
  • Rezultatul
  • Blocarea activității TLR2 reduce și stabilizează leziunile aterosclerotice din artera brahiocefalică
  • Blocarea TLR2 ameliorează inflamația arterelor aterosclerotice
  • Blocarea TLR2 reduce apoptoza macrofagelor și expresia CHOP în leziunile aterosclerotice avansate
  • TLR2 mediază producția accelerată de aterosclerotici și reglează expresia CHOP și apoptoza la șoarecii cu deficit de ApoE cărora li se administrează o dietă HC.
  • discuţie
  • Contribuția autorului

abstract

Semnalizarea receptorului de tip 2 (TLR2) joacă un rol crucial în inițierea aterosclerozei. Scopul acestui studiu a fost de a investiga dacă blocarea activității TLR2 poate avea efecte terapeutice asupra aterosclerozei avansate.

metode:

Patruzeci de săptămâni de deficit de apolipoproteină E (ApoE -/-), cărora li s-a administrat o dietă normală, au fost injectate intravenos cu un anticorp neutralizant TLR2 sau IgG asociat cu izotip timp de 18 săptămâni. Șoarecii dublu knockout ApoE -/- Tlr2 -/- au fost considerați martori pozitivi. La sfârșitul tratamentului, s-au măsurat nivelurile lipidice plasmatice și s-au analizat morfologia plăcii, expresia citokinelor proinflamatorii și apoptoza arterială. În a doua parte a acestui studiu, șoarecii ApoE -/- și ApoE -// Tlr2 -/- de șase săptămâni hrăniți cu o dietă bogată în colesterol timp de 12 până la 24 de săptămâni au fost examinați pentru nivelurile de expresie ale TLR2 și markeri apoptotici arterelor.

rezultatele:

Blocarea activității TLR2 de către un anticorp neutralizant TLR2 sau eliminarea genei Tlr2 nu a modificat nivelul lipidelor plasmatice la șoarecii ApoE -/-. Cu toate acestea, manipulările farmacologice și genetice au redus semnificativ dimensiunea plăcii și stenoza vasculară și au crescut stabilitatea plăcii în arterele brahiocefalice. Efectele protectoare ale antagonismului TLR2 au fost asociate cu exprimarea suprimată a citokinelor pro-inflamatorii IL-6 și TNF-α și cu inactivarea factorilor de transcripție NF-κB și Stat3. În plus, blocarea activității TLR2 a atenuat apoptoza macrofagelor indusă de stresul ER în arterele brahiocefalice, care ar putea promova diferențierea nucleilor necrotici în ateroscleroza avansată. În plus, o dietă bogată în colesterol a accelerat semnificativ producția aterosclerotică și a crescut expresia proteinei proapoptotice CHOP și apoptoza la șoarecii ApoE -/- decât la șoarecii ApoE -/- Tlr2 -/-.

concluzie:

Blocarea farmacologică sau genetică a activității TLR2 reduce și stabilizează leziunile aterosclerotice avansate la șoarecii ApoE -/-. Astfel, vizarea semnalizării TLR2 poate fi o strategie terapeutică promițătoare împotriva aterosclerozei avansate.

Ateroscleroza este o cauză frecventă a bolilor cardiovasculare. Boala cardiovasculară este principala cauză de deces și o amenințare tot mai mare pentru sănătatea umană la nivel mondial 1. Studiile epidemiologice și experimentale au confirmat un rol predominant în inflamație în toate etapele aterosclerozei, de la formarea plăcilor aterosclerotice stabile timpurii până la plăcile avansate care sunt predispuse la ruptură 2, 3, 4, 5. Mai multe studii s-au concentrat recent asupra efectelor intervențiilor farmacologice asupra stabilității plăcilor avansate, întrucât întreruperea leziunilor instabile contribuie la sindromul coronarian acut 4, 6, 7. Plăcile instabile sunt caracterizate de nuclee necrotice mari umplute cu lipide încapsulate într-un capac subțire fibros, niveluri ridicate de mediatori proinflamatori și proteaze matriciale și apoptoză. Dezvoltarea plăcilor instabile este asociată cu implicarea atât a sistemelor imune înnăscute, cât și a celor adaptative.

Receptorii asemănători taxelor (TLR) sunt o familie de receptori care recunosc tiparele, care joacă un rol cheie în imunitatea înnăscută și inițiază răspunsuri inflamatorii. Ligarea acestor receptori inițiază activarea factorului nuclear-KB (NF-kB), ducând la exprimarea unei game largi de gene inflamatorii 8, 9. Dintre TLR-urile caracterizate, TLR2 este unic prin capacitatea sa de heterodimerizare cu TLR1 sau TLR6, ducând la o specificitate relativ largă a ligandului, incluzând atât liganzi endogeni cât și exogeni 10, 11. În special, toți potențialii agoniști endogeni TLR2, inclusiv biglycan, cutia cu proteină cromozomială 1 foarte mobilă (HMGB1) și componentele lipoproteice oxidate, se găsesc în leziunile aterosclerotice 12, 13, 14. În plus, calea de semnalizare TLR2 este asociată cu răspunsul la stres al reticulului endoplasmatic (ER). Stresul ER poate crește expresia TLR2 in vitro și in vivo, iar TLR2 contribuie la apoptoză în macrofage care suferă stres ER indus de lipide 15. Astfel, TLR2 poate fi o țintă potențială pentru intervenții terapeutice în tratamentul aterosclerozei.

Într-adevăr, liganzii TLR2 și supraexpresia TLR2 au fost observate în plăcile aterosclerotice umane, iar rolul important al TLR2 în inflamația și degradarea matricei este indicat de celulele găsite în leziunile aterosclerotice ale carotidei umane 16, 17. În plus, deficiența genei TLR2 într-un model de șoarece a inhibat semnificativ progresia aterosclerozei timpurii 18, 19. Cu toate acestea, există date limitate despre efectele TLR2 asupra leziunilor avansate la modelele animale. Folosind inhibiția farmacologică și genetică a activității TLR2, am investigat efectele terapeutice și profilactice ale blocadei TLR2 asupra plăcilor aterosclerotice avansate din artera brahiocefalică a șoarecilor cu deficit de apolipoproteină E (ApoE), care nu au fost încă evaluate. Am constatat că blocarea activității TLR2 reduce și stabilizează leziunile aterosclerotice avansate la șoarecii cu deficit de ApoE prin atenuarea inflamației și a stresului ER în vasele de sânge. Munca noastră sugerează că activitatea TLR2 joacă un rol crucial în patogeneza aterosclerozei avansate și că blocarea acestei căi de semnalizare poate fi o strategie promițătoare în tratamentul aterosclerozei și a complicațiilor sale.

Materiale și metode

Animale și design experimental

Șoarecii ApoE -/- Tlr2 -/- au fost generați din încrucișări heterozigote ale șoarecilor ApoE -/- (fundal C57BL/6, Laboratorul Jackson) și șoareci Tlr2 -/- (fundal C57BL/6, Laboratorul Jackson). Genotipurile șoarecilor homozigoti knockout dublu sau single knockout ApoE au fost confirmate prin PCR așa cum este descris mai sus 18. Toate animalele au fost adăpostite în condiții standard pentru umiditate, temperatura camerei și cicluri de lumină întunecată, cu acces la apă și alimente ad libitum. Studiile au fost efectuate în conformitate cu principiile stabilite de Comitetul instituțional pentru etica îngrijirii și tratamentului animalelor în cercetarea biomedicală (Beijing, China).

În primul experiment, toți șoarecii au fost hrăniți cu o dietă normală [4% (greutate/greutate) Grăsime, 20% (greutate) proteină, GB-14924]. La vârsta de 40 de săptămâni, șoarecii ApoE -/- Tlr2 +/+ au fost împărțiți aleatoriu în 3 grupuri (n = 16 per grup) și tratați cu soluție salină, anticorp IgG asociat cu izotip (SouthernBiotech, Birmingham, AR, SUA) sau TLR2 anticorp neutralizant. (R&D System, Minneapolis, MN, SUA) intravenos. Dozajul și momentul administrării anticorpului (ab) au fost determinate pe baza studiilor noastre anterioare 20, 21. Prima schemă de dozare a fost de 200 μg/kg la fiecare 4 zile timp de 2 săptămâni, iar dozele rămase au fost de 100 μg/kg o dată pe săptămână pentru alte 16 săptămâni. Șoarecii ApoE -/- Tlr2 -/- numiți grupul knockout dublu (DK) au fost adăpostiți în aceleași condiții. Toți șoarecii au fost sacrificați la vârsta de 58 de săptămâni. În al doilea experiment, șoarecii ApoE -/- Tlr2 +/+ și ApoE -/- Tlr2 -/- au fost hrăniți cu o dietă aterogenă cu un conținut ridicat de colesterol (HC) [15,8% (g/g) Grăsimi, 1,25% (w)/w) wt) colesterol] de la vârsta de 6 săptămâni și au fost sacrificați pentru analiză la vârsta de 12, 18 și 24 de săptămâni (n = 8 per grup).

Colectarea și prelucrarea țesuturilor

După ce șoarecii au fost posti timp de 4 ore, sângele a fost obținut pentru măsurarea lipidelor folosind un plex venos retro-orbital. Șoarecii au fost apoi anesteziați cu 50 mg/kg ip pentobarbital și perfuzați prin ventriculul stâng cu soluție salină tamponată cu fosfat rece ca gheața la presiune fiziologică. Aortele au fost excizate rapid, congelate instantaneu din arcada aortică pentru bifurcația ileală și menținute la -80 ° C înainte de analiza proteinelor. Întreaga arteră brahiocefalică de la fiecare animal a fost fixată în paraformaldehidă 4% timp de 24 ore la 4 ° C, încorporat în parafină și tăiat în serie (5 μm grosime).

Analiza biochimică

Nivelurile plasmatice ale colesterolului total, ale colesterolului cu lipoproteine ​​cu densitate ridicată (HDL-C), ale colesterolului cu lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL-C) și ale trigliceridelor au fost determinate folosind truse comerciale (Biosino, Beijing, China) conform instrucțiunilor producătorilor.,

Colorare histologică și imunohistochimică

Fiecare a cincea secțiune a secțiunilor seriale a fost colorată cu colorare modificată cu pentacrom Movata sau roșu Sirius pentru a evalua compoziția și stabilitatea plăcilor aterosclerotice avansate în artera brahiocefalică și au fost analizate 12 până la 15 secțiuni pe șoarece pentru fiecare culoare. Secțiunile colorate au fost fotografiate la mărirea 200x și 2-3 secțiuni pe secțiune care conțin întreaga leziune au fost capturate și analizate folosind Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, SUA). Media tuturor secțiunilor a reprezentat o leziune aterosclerotică a unui șoarece.

Pentru colorarea imunohistochimică, cel puțin 4 secțiuni de artă brahiocefalică pe șoarece au fost incubate cu anticorp macrofag anti-șoarece de șobolan (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, SUA), cu anticorp monoclonal anti-mușchi anti-șoarece. actină (α-SMA, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, CA, SUA) sau anticorp anti-matrice metaloproteinază (MMP) -2 de iepure (1: 100, Abcam, Cambridge, Marea Britanie). Anticorpii legați au fost complexați cu anticorpi secundari asociați peroxidazei și detectați cu diaminobenzidină. Secțiunile colorate au fost fotografiate la o mărire de 200x și 2 până la 3 câmpuri vizuale care conțin întreaga leziune pe secțiune au fost capturate și analizate folosind Image-Pro Plus 5.0. Media tuturor secțiunilor a reprezentat expresia proteinelor țintă în leziunea aterosclerotică.

Pentru a evalua co-localizarea macrofagelor și a proteinei omoloage C/EBP (CHOP), a anticorpului macrofag anti-șoarece de șobolan (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, SUA) și a anticorpului monoclonal anti-CHOP de șoarece 1: 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA) au fost folosiți ca anticorpi primari. Patru secțiuni de țesut per șoarece au fost incubate cu pui anti-șobolani marca Alexa 647 și anticorpi secundari de iepure marcați 488 Alexa (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Secțiunile au fost vizualizate folosind un microscop confocal E2000U și evaluate cu ajutorul software-ului Leica TCS SP2.

Testele dUTP mediate TdT in situ pentru marcarea N-terminală

Celulele apoptotice din leziunile aterosclerotice au fost detectate prin etichetarea nick-end dUTP mediată de TdT (TUNEL) folosind kituri (Promega, Madison, WI, SUA). Nucleii au fost colorați cu DAPI. Nucleii pozitivi TUNEL au fost numărați sub un microscop de fluorescență inversat Olympus I720. Pentru a evalua co-localizarea macrofagelor, macrofagele au fost detectate folosind un anticorp macrofag anti-șoarece de șobolan (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, SUA) urmat de un anticorp secundar de pui denumit Alexa 647. (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA).

Western blots

După omogenizarea țesuturilor, proteinele extrase au fost separate prin 12% SDS-PAGE și imunoblotate cu anticorpi specifici, inclusiv anti-MMP-2 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie), anti-fosfo-NF-κB p65, anti-NF. -KB p65, caspază-3 clivată, anti-CHOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA), anti-phospho-Stat3, anti-Stat3, anti-interleukin (IL) -6, anti-IL-10 sau factor necroză antitumorală (TNF) -α (Santa Cruz Biotechnology, CA, SUA). Semnalele secundare ale anticorpilor au fost detectate folosind reactivi ECL Plus Western blot (Amersham Biosciences, PA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului.

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Comparații între mai multe grupuri au fost efectuate cu ANOVA unidirecțional utilizând SPSS. Datele care nu au prezentat o distribuție normală au fost analizate folosind testul U Mann-Whitney. P

Blocarea activității TLR2 nu afectează nivelul lipidelor plasmatice. Nivelurile totale de colesterol (A), trigliceride (B), LDL-C (C) și HDL-C (D) au fost determinate la șoareci ApoE -/- în vârstă de 58 de săptămâni tratați cu ser fiziologic, IgG sau TLR2ab iv timp de 18 săptămâni și în șoarecii ApoE -/- deficienți TLR2 (DK) au fost hrăniți cu hrană pentru animale. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 12 șoareci/grup).

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Blocarea TLR2 reduce și stabilizează plăcile aterosclerotice avansate în artera brahiocefalică. (A și B) colorarea Movat a arătat compoziția leziunilor avansate din grupurile cu ser fiziologic, IgG și TLR2ab și TLR2. Săgețile indică eroziunea mediului. Barele de scară reprezintă 200 μm în panoul A și 50 μm în panoul B. Administrarea TLR2ab timp de 18 săptămâni și deficitul TLR2 au redus semnificativ zona leziunii medii (C), stenoza maximă a leziunii (D), nucleii necrotici maximi/placa (E), și grosime medie minimă (F) la șoareci cu deficit de ApoE. L, lumen; M, mass-media. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 10 șoareci/grup). b P

Blocarea TLR2 stabilizează plăcile aterosclerotice avansate. În grupurile de colorare TLR2ab și TLR2 deficiente, colorarea roșie Sirius a prezentat un conținut crescut de colagen (A). Colorarea imunohistochimică a relevat o distribuție mai abundentă a celulelor musculare netede (B) și acumularea redusă de macrofage (C) în leziunile arterei brahiocefalice. Barele scalei reprezintă 50 μm. L denotă lumen. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 10 șoareci/grup). b P c P

Blocarea TLR2 inhibă inflamația vasculară în arterele aterosclerotice. Expresia MMP-2 (A și B), fosforilarea NF-κB p65 (C), fosforilarea Stat3 (D) și expresia citokinei a IL-6, TNF-a și IL-10 (E) au fost reduse în TLR2ab- tratate și TLR2- deficiente. Barele scalei reprezintă 50 μm. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 6 șoareci/grup). b P

O dietă bogată în colesterol (HC) crește expresia TLR2 în macrofage și blocarea TLR2 reduce expresia CHOP indusă de HC și apoptoza în leziunile aterosclerotice. (A) Colorarea Movat a relevat morfologia plăcii în arterele brahiocefalice ale șoarecilor ApoE -/- Tlr2 +/+ și ApoE -/- Tlr2 -/-. Barele scalei reprezintă 200 μm. Deficitul de TLR2 a redus semnificativ aria leziunii medii (B) și dimensiunea nucleului necrotic (C) (n = 8 șoareci/grup). (D) Imunofluorescența dublă a relevat infiltrarea macrofagelor care exprimă TLR2 în leziuni în arterele brahiocefale ale șoarecilor ApoE -/- cu vârsta cuprinsă între 12 și 24 de săptămâni, care au fost plasate pe diete aterogene de la vârsta de 6 săptămâni. Barele scalei reprezintă 20 μm. La această vârstă, șoarecii ApoE -/- Tlr2 -/- au prezentat expresie semnificativ redusă a CHOP (E), Bcl-2 (F) și caspază-3 (G) scindată în aortă. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 4-6 șoareci/grup). b Șoareci P -/- de aceeași vârstă. e P -/- la vârsta de 12 săptămâni pe hrană pentru hrănire.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

discuţie

Procesele inflamatorii joacă un rol cheie în dezvoltarea aterosclerozei. TLR2 s-a dovedit a fi implicat în acest proces 11, 27. În concordanță cu studiile anterioare ale etapelor incipiente ale aterosclerozei, blocarea activității TLR2 a redus infiltrarea macrofagelor în plăci; expresia mediatorilor inflamatori, inclusiv MMP-2, TNF-a și IL-6; și inactivarea factorului de transcripție NF-κB 20, 21, 23. În plus, antagonismul TLR2 a inhibat, de asemenea, expresia mediatorilor imunosupresori IL-10 și a factorului de transcripție Stat3, sugerând că beneficiile blocării TLR2 depind de inhibarea extinsă a inflamației. Acest studiu oferă primele dovezi ale inflamației induse de TLR2 în leziunile avansate pentru a completa rolul de contribuție identificat anterior al TLR2 în ateroscleroza timpurie.

Instabilitatea plăcii este o caracteristică importantă a aterosclerozei avansate. Deși mecanismele care stau la baza rupturii plăcii rămân evazive, s-a dovedit că mulți factori contribuie la acest proces, inclusiv acumularea de macrofage, niveluri ridicate de mediatori pro-inflamatori, supraactivarea MMP și VSMC și apoptoza macrofagelor. În plus față de reglarea răspunsurilor inflamatorii, am observat că blocarea TLR2 a redus apoptoza macrofagelor prin analiza TUNEL și imunofluorescență.

Pe scurt, am demonstrat că gena knockout TLR2 la șoareci ApoE -/- a redus dimensiunea plăcii și a crescut stabilitatea plăcii în artera brahiocefalică în timpul aterosclerozei avansate datorită inhibării inflamației induse de stres ER și a apoptozei macrofagelor. strategie terapeutică împotriva aterosclerozei avansate. Deoarece expresia crescută a TLR2 pe celulele endoteliale este necesară pentru a iniția boala, TLR2 poate media sau amplifica semnalele apoptotice induse de stres ER în leziunile aterosclerotice avansate. Munca noastră sugerează că blocada farmacologică a semnalizării TLR2 este o abordare atractivă pentru tratamentul viitor al aterosclerozei.

Contribuția autorului

Studiul a fost proiectat de Xiao-xing WANG și Zhuo-wei HU; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV și Hui-min YAN au contribuit la dezvoltarea metodologiei; Experimentele au fost efectuate de Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV, Jia-ping WANG, Hui-min YAN, Zi-yan WANG, Han-zhi LIU și Xiaoning FU; Xiao-xing WANG și Zhuo-wei HU au analizat datele și au scris o lucrare.