obiecte

abstract

Sarcina principală în proiectarea vaccinurilor profilactice împotriva cancerului este de a defini antigeni imunogeni și siguri pentru cancer. Datorită asemănării puternice a modelelor de expresie a antigenului între cancer și țesuturile embrionare, am definit o strategie prototip folosind o proteină gp96 proteină de șoc termic derivată din placentă care induce răspunsuri profilactice ale celulelor T împotriva tumorilor. Imunizarea cu gp96 placentară a asigurat protecție parțială și imunitate anti-tumorală pe termen lung (cel puțin 3 luni) împotriva creșterii melanomului transplanabil sau a tumorilor mamare la șoareci, provocând protecție completă împotriva 7,12-dimetilbenz (a) -antracen (DMBA) . a indus tumori mamare la șobolani și a redus semnificativ incidența și creșterea tumorilor mamare autohtone la șoarecii transgenici HER2. Placental gp96 a activat răspunsurile celulelor T HER2 și MUC1 specifice prin legarea la antigenele asociate tumorii. Rezultatele noastre arată noua imunogenitate a gp96 placentară și utilizarea sa potențială ca vaccin multivalent pentru cancer.

În ciuda progreselor remarcabile în înțelegerea cauzelor cancerului și a progreselor semnificative în tratamentul cancerului în ultimii ani, boala persistă, iar incidența cancerului este în creștere la nivel mondial 1. Spre deosebire de vaccinurile profilactice extrem de eficiente împotriva bolilor infecțioase, vaccinurile terapeutice împotriva cancerului care nu cauzează tulburări autoimune inacceptabile nu au fost la fel de eficiente, producând doar efecte terapeutice incrementale 2. Cea mai simplă explicație poate fi că utilizarea vaccinurilor terapeutice pentru tratarea tumorilor stabilite este echivalentă cu abordarea nereușită a utilizării vaccinurilor împotriva virusului hepatitei B (HBV) sau a virusului papilomavirusului uman (HPV) pentru tratarea infecției cronice cu VHB sau HPV. S-a raportat că mai multe mecanisme de inversare implică scurgeri tumorale și suprimarea sistemului imunitar, probabil din cauza dezvoltării, debutului și creșterii tumorale pe termen lung, inclusiv răspunsuri afectate ale celulelor T, toleranței imune și micro-mediului tumorii supresive care este probabil . sinergic 3. Acest lucru subliniază necesitatea dezvoltării unei abordări profilactice a vaccinului împotriva cancerului, care să ofere o raționalizare ieftină și extrem de eficientă.

O provocare majoră în proiectarea vaccinurilor profilactice împotriva cancerului este de a defini antigeni imunogeni și siguri pentru cancer care pot servi drept ținte pentru vaccinuri eficiente, inclusiv antigene specifice tumorilor și proteine ​​supraexprimate pe tumoare, dar nu pe țesuturi normale. Până în prezent, doar un număr limitat de antigeni cancerigeni au fost identificate cu mai multe succese 4, 5, 6. Este bine documentat că majoritatea tipurilor de tumori solide exprimă antigene embrionare în grade diferite și există o puternică similitudine în expresia antigenului între cancer și țesuturile embrionare, care oferă potențialul de a viza componentele embrionare ca strategie eficientă de prevenire a cancerului 7. Vaccinarea cu antigeni embrionari sau cu celule stem duce la un răspuns imun protector puternic împotriva cancerului 8, 9, 10. Ca organ temporar care schimbă substanțe nutritive și produse reziduale între mamă și făt, placenta prezintă, de asemenea, o expresie mai mare a genei legate de cancer, inclusiv IGF2, HIF-2a, GPC3, proteina plasmatică A (PAPP-A) legată de sarcină și MUC1 11 .

Ca membru al familiei de proteine ​​de șoc termic (HSP) de 90, gp96 are o capacitate unică de a se lega de peptidele antigenice, de a prezenta acești antigeni încărcați la moleculele MHC clasa I și clasa II și de a activa celulele T specifice 12, 13. Studiile noastre anterioare arată că în cancerul hepatic infectat cu virusul hepatitei B (VHB), gp96 leagă peptidele derivate de virus și activează răspunsurile CTL specifice prin prezentarea antigenului 14, 15. În plus, studii recente oferă dovezi convingătoare ale activării gp96 a macrofagelor și celulelor dendritice prin interacțiunea cu un subset de receptori Toll-like (TLR) sau CD91 16, 17, 18, 19. Studii clinice care utilizează complexe autologe de peptide gp96 ca vaccinuri terapeutice au fost inițiate pentru a trata o serie de tumori cu efecte antitumorale ușoare 20. Pe baza observațiilor de mai sus, scopul acestui studiu a fost de a determina dacă gp96 (P-gp96) derivat din placentă induce răspunsuri profilactice antitumorale ale celulelor T.

Rezultatul

Am testat mai întâi capacitatea vaccinului gp96 derivat din placentă de a preveni tumorile folosind teste de provocare tumorală. Proteina Gp96 a fost extrasă din placentă sau din țesuturile hepatice ale șoarecilor C57BL/6 așa cum s-a descris mai sus 21. Șoarecii C57BL/6 au fost imunizați subcutanat de trei ori cu gp96 derivat din placentă (P-gp96), gp96 derivat din ficat (L-gp96) sau PBS (fără imunizare) ca martor. La o săptămână după ultima imunizare, șoarecii au fost stimulați subcutanat cu celule de melanom B16-F10 (5 x 104 celule/șoarece). Comparativ cu L-gp96 sau PBS, imunizarea cu P-gp96 a inhibat semnificativ creșterea tumorii, reducând volumul tumorii cu aproximativ 49 sau 45% în ziua 30 (ambele P

gp96

Am testat în continuare dacă imunizarea cu P-gp96 ar putea oferi imunitate de protecție antitumorală pe termen lung. Șoarecii C57BL/6 au fost vaccinați de trei ori cu P-gp96 sau L-gp96 derivate de la șoareci C57BL/6. La trei luni de la ultima imunizare, șoarecii au fost inoculați subcutanat cu B16-F10 (5 x 104 celule/șoarece). Comparativ cu niciun tratament, creșterea tumorii a fost încetinită la șoarecii tratați cu P-gp96, dar nu cu L-gp96 (P-gp96).

Șoarecii C57BL/6 (a - d) sau BALB/c (e - h) femele au fost imunizați de trei ori cu P-gp96, L-gp96 sau PBS. La trei luni după a treia imunizare, șoarecilor li s-au administrat 5 x 104 celule B16-F10 sau 6 x 105 celule TUBO subcutanat. (a, e) Sarcina tumorii a fost măsurată la intervale de 2 zile. (b, f) Diagrama Kaplan-Meier a supraviețuirii șoarecilor după diferite vaccinări. (c, g) Splenocitele de la șoareci imunizați au fost stimulate cu B16-F10 (c) sau TUBO (g) antigene de lizat cu celule întregi sau BSA pentru evaluarea de fond și testate prin IFN-y ELISPOT. (d, h) Splenocitele au fost stimulate cu celule B16-F10 (d) sau TUBO (h) iradiate in vitro timp de 3 zile și analizate pentru activitatea citotoxică de către FACS utilizând celule B16-F10 marcate cu CFSE sau celule TUBO ca celule țintă. Barele de eroare indică sd ** P

discuţie

Studiul nostru a arătat că gp96 izolat din placentă inițiază răspunsuri specifice celulelor T tumorale prin asocierea cu antigeni ai carcinomului embrionar, iar imunizarea gp96 oferă profilaxie împotriva xenogrefelor tumorale, precum și a cancerelor induse de cancer sau spontane. Având în vedere asemănarea antigenică dintre cancer și țesuturile embrionare 7 și capacitatea gp96 de a lega întregul repertoriu peptidic generat în celula 13, rezultatele noastre oferă, așadar, o bază rațională pentru dezvoltarea unui vaccin profilactic pentru cancer multivalent.

metode

Probele umane

Țesuturile hepatice normale au fost obținute din porțiuni neutilizate de cinci ficat de ficat utilizate pentru transplantul de ficat la spitalul You'an din Beijing, Universitatea Centrală de Științe Medicale. Probele de placentă au fost prelevate de la cinci femei spitalizate la cel de-al treilea spital al Universității din Beijing din iulie 2011 până în decembrie 2011. Toți participanții la studiu au dat consimțământul scris în scris. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică al Spitalului Beijing You'an și Comitetul de Etică al celui de-al Treilea Spital din Beijing.

Linii telefonice

TUBO este o linie celulară clonată generată dintr-o tumoare mamară spontană de la un șoarece BALB-neuT și exprimă foarte mult proteina HER-2 pe membrana celulară. Celulele TUBO au fost cultivate în mediu DMEM (GIBCO) conținând 10% ser de vițel fetal (FBS), 25 ug/ml streptomicină și 100 UI/ml penicilină. Celulele B16-F10 au fost cultivate în mediu RPMI 1640 (GIBCO) suplimentat cu 10% FBS, 25 ug/ml streptomicină și 100 UI/ml penicilină.

Șoareci și șobolani

Șoarecii BALB/c femele (6-8 săptămâni) și șoarecii C57BL/6 (6-8 săptămâni) au fost achiziționați de la Centrul pentru Cercetări Animale din cadrul Departamentului Medical al Universității din Beijing (Beijing, China). FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 șoareci Mul/J (cu vârsta cuprinsă între 6 și 7 săptămâni) au fost furnizați cu amabilitate de către prof. Mingzhao Zhu (Institutul de Biofizică, Academia Chineză de Științe, Beijing, China). Șobolani femele Wistar (6-7 săptămâni) au fost obținute de la Beijing HFK Bio-technology Co. Ltd. (Beijing, China). Toate experimentele la șoareci și șobolani au fost efectuate în strictă conformitate cu regulile Institutului de Microbiologie al Academiei Chineze de Științe a Comitetului pentru Etica Cercetării.

Pregătirea gp96

P-gp96 de șoarece, șobolan și uman și L-gp96 de șoarece au fost purificate prin cromatografie de afinitate ConA-Sepharose urmată de cromatografie cu schimb de anioni de la șoareci, șobolani și placente umane sau țesuturi hepatice. .

Vaccinarea șoarecilor și șobolanilor

În studiile profilactice, șoarecii BALB/c și C57BL/6 au fost imunizați prin injecție subcutanată în abdomen cu 20 μg P-gp96/șoarece, 20 μg L-gp96/șoarece sau PBS singur în săptămânile 1, 2 și 4. La o săptămână după a treia imunizare, șoarecilor li s-au administrat 6 x 105 celule TUBO/șoarece sau 5 x 104 celule B16-F10/șoarece subcutanat. În studiile terapeutice, șoarecii BALB/c au fost stimulați subcutanat cu 6 x 105 celule TUBO/șoarece. În a doua zi, șoarecii au fost imunizați cu 20 μg P-gp96/șoarece, 20 μg L-gp96/șoarece sau PBS singuri de trei ori la intervale de trei zile. Pentru a evalua imunitatea de protecție pe termen lung, șoarecii BALB/c și C57BL/6 au fost imunizați prin injecție subcutanată în flancurile abdominale cu 20 μg P-gp96/șoarece, 20 μg L-gp96/șoarece sau PBS singur în săptămânile 1-2. și 4. La trei luni după a treia imunizare, șoarecilor li s-au administrat 6 x 105 celule TUBO/șoarece sau 5 x 104 celule B16-F10/șoarece subcutanat. Fiecare grup conținea cel puțin 10 șoareci. Dimensiunea tumorii a fost apoi măsurată la fiecare două zile. Șoarecii au fost observați timp de 50 de zile pentru a supraviețui.

Șoarecii feminini FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 Mul/J au fost inoculați prin injecție subcutanată în abdomen cu 25 μg P-gp96/mouse, 25 μg L-gp96/mouse sau PBS de trei ori în săptămânile 1, 2 și 4 Apariția și creșterea tumorii au fost monitorizate la intervale regulate. Șobolanii femele Wistar au fost vaccinați prin injecție subcutanată în abdomen cu 25 μg P-gp96/șobolan sau PBS de trei ori în săptămânile 1, 2 și 4. La o săptămână după ultima imunizare, șobolanii au fost induși să dezvolte cancer de sân, oferind 20 μg/100 g greutate corporală, greutate DMBA (Sigma) în 1 ml de ulei de porumb folosind un tub gastric. Experimentul a fost încheiat la 21 de săptămâni după expunerea la DMBA.

Dimensiunea tumorii a fost determinată prin măsurarea celui mai mic diametru (a) și a celui mai mare diametru (b) cu un etrier. Volumul tumorii a fost calculat folosind formula: V = (a2b)/2.

Pregătirea DC și imunizarea

Măduva osoasă a fost îndepărtată de pe femuri și tibiile șoarecilor C57BL/6 sau BALB/c prin clătirea canalului medular cu PBS. Măduva osoasă a fost filtrată printr-un filtru de celule de nailon de 100 μm înainte ca eritrocitele să fie lizate în tampon NH 4 CL 0,83 M. Celulele au fost resuspendate în RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal de vițel, 100 U/ml penicilină, 100 ug/ml streptomicină, 50 ng/ml șoarece recombinant GM-CSF (R&D Systems) și 20 ng/ml șoarece recombinant IL-4 ( Sisteme R&D) la o concentrație de 1 x 107 celule/ml și cultivate la 37 ° C. Precursorii DC au fost cultivați prin adăugarea a 2 ml mediu la fiecare două zile. În ziua 7, DC-urile au fost recoltate și stimulate cu lizate de celule tumorale B16-F10 sau TUBO la o concentrație de 50 μg proteină/ml timp de 24 de ore. Proporția DC în cultură a fost în mod constant de 90%, determinată de analiza citometriei în flux.

Șoarecii BALB/c și C57BL/6 au fost imunizați prin injecție subcutanată în flancul abdominal cu 20 μg de P-gp96/șoarece, 1 x 106 DC/șoarece sau PBS singur în săptămânile 1, 2 și 4. a treia imunizare, șoarecilor li s-au administrat 6 x 105 celule TUBO/șoarece sau 5 x 104 celule B16-F10/șoarece subcutanat.

Transfer adoptiv de celule T

Splenocitele au fost izolate din splina șoarecilor BALB/c imunizați cu P-gp96, L-gp96 sau neimunizați (PBS) așa cum este descris. Celulele T CD3 + au fost îmbogățite (> 90%) prin separarea magnetică a mărgelelor (Miltenyi, Biotec, Germania) de splenocite cultivate. Celulele T purificate (2x107) au fost injectate intravenos în șoareci BALB/c iradiați cu γ (500 rad), urmate de expunerea subcutanată la 6 x 105 celule TUBO/șoarece. Dimensiunea tumorii a fost măsurată la intervale regulate și șoarecii au fost monitorizați timp de 50 de zile pentru supraviețuire.

Colecția de celule mononucleare periferice (PBMC)

PBMC-urile au fost izolate din sânge proaspăt heparinizat a cinci donatori sănătoși prin centrifugare cu gradient de densitate Ficoll-Hypaque (sănătate GE).

Analiza spotului imunosorbent legat de enzime (ELISPOT)

Testele IFN-γ de șoarece și ELISPOT IFN-γ uman au fost efectuate conform protocolului furnizat de producător (Mabtech, Mariemont, OH). Pe scurt, splenocite de șoarece izolate sau PBMC umane (la numărul indicat de celule/godeu pulsat cu stimuli diferiți, respectiv) au fost adăugate la godeu în triplicat și incubate la 37 ° C timp de 18-36 ore. Celulele de colorare (SFC) au fost numărate și analizate folosind un cititor ELISPOT (Biosys, Germania). Respectivele peptide de control au fost utilizate ca control de fond.

Test de citotoxicitate a celulelor T

Citoliza a fost determinată cu 5- (6) -carboxi-fluoresceină-succinimidil ester (CFSE) și iodură de propidiu (PI) prin două pete de fluorocrom. Splenocite de șoarece sau PBMC umane au fost utilizate ca celule efectoare. Celulele B16-F10, TUBO și MCF-7 au fost utilizate în test ca celule țintă. Celulele țintă au fost pre-marcate cu CFSE și amestecate cu celule efectoare în diferite rapoarte într-un volum final de 200 μl. După 5 ore de incubare la 37 ° C, celulele moarte au fost marcate cu PI. Probele au fost analizate prin sortare de celule activate cu fluorescență (FACS) utilizând software-ul CellQuest (BD Biosciences).

Analiza PCR în timp real

imunocitochimie

Tumorile mamare de șobolan, fixate în 4% formalină tamponată, au fost încorporate în parafină folosind un sistem automat convențional. Țesuturile încorporate în parafină (secțiuni de 5 μm) au fost colorate cu hemotoxilină-eozină.

analize statistice

Valorile sunt exprimate ca media ± SD Diferențele în volumul mediu al tumorii, SFC, procentul de ucidere și nivelurile relative de expresie a ARNm între șoarecii tratați cu PBS, P-gp96 și L-gp96 au fost comparate cu testul t Student și analiza varianței (ANOVA) și comparație post-hoc folosind testul lui Tukey. Diferențele dintre curbele Kaplan-Meier au fost comparate cu testul log-rank.

Informatii suplimentare

Fișiere PDF

Informatii suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.