obiecte

abstract

Foarte puține studii au analizat modul în care compoziția microbiomului mamei afectează dezvoltarea microflorei intestinale și orale a sugarilor în primele luni de viață. Aici, microbioza prezentă în intestinele mamei, vaginului, laptelui matern, cavității bucale și venei mamare a fost comparată cu intestinele și microbioza orală a bebelușilor lor în primele șase luni după naștere. Probele au fost prelevate din locurile corpului indicate de la șapte mame și nouă copii la trei momente de timp diferite pe o perioadă de 6 luni. Fiecare probă a fost analizată prin secvențierea genei ARNr 16S. Microflora intestinală a sugarilor conținea diferite comunități microbiene care aveau o asemănare mică cu diferite comunități de microbi materni. În contrast, microbiota orală a sugarilor a arătat o asemănare mare cu microbioza laptelui matern, a sânului și a curților mamare. Aceste rezultate arată că contactul constant între comunitățile microbiene mărește similitudinea lor. Majoritatea unităților taxonomice operative din intestinele sugarilor și microbioza orală au fost, de asemenea, împărtășite cu intestinele intestinale și comunitățile orale. Diferența dintre similitudinea și proporția OTU-urilor distribuite între microflora intestinală a sugarilor și mamelor poate fi legată de diversitatea mai mică și, prin urmare, de concurența în microflora intestinală a sugarilor.

Scopul acestui studiu a fost, prin urmare, de a compara efectul diferitelor comunități microbiene materne - intestinal, vaginal, oral, laptele matern și glanda mamară asupra dezvoltării microflorei intestinale și orale a sugarilor în primele șase luni ale populației infantile. viaţă.

Material si metode

Grup de studiu și eșantionare

Femeile însărcinate au fost incluse în acest studiu în prima perioadă de debut spontan al travaliului sau cu până la 24 de ore înainte de operația cezariană electivă cu membrane amniotice intacte. Au fost înscrise la secția clinicii pentru femei de la Spitalul Universitar Tartu în perioada mai 2012 - septembrie 2013. Toate femeile admise au avut sarcini necomplicate, nu au avut boli infecțioase care necesită tratament cu antibiotice și nu au avut diabet în trecut. sau tulburări hipertensive în a doua jumătate a sarcinii. Un total de șapte mame (vârsta medie: 33,1 ± 4,5 ani) au fost adoptate împreună cu nou-născuții lor (perechi mamă-sugar). Două cupluri au inclus gemeni și toți cei patru copii au fost incluși în acest studiu. O singură femeie nu era multipară (paritate medie, 1,4 ± 0,8). Cinci femei au născut prin cezariană și au primit tratament profilactic cu cefuroximă înainte de incizie la nivelul pielii. Toți nou-născuții au fost medii (vârsta gestațională medie, 38,9 ± 1,6 săptămâni) și au avut o greutate normală la naștere (greutatea medie, 3,379,3 ± 564,1 g). Factorii clinici care descriu cuplurile materne și infantile sunt enumerați în tabelele suplimentare S1.

Au fost prelevate șase tipuri de probe de la fiecare pereche de mame și bebeluși înainte de naștere sau la 48 până la 72 de ore după naștere, la 6 până la 8 săptămâni și la 6 luni după naștere. În plus, o probă de tampon vaginal a fost luată de la fiecare mamă înainte de naștere. Au fost prelevate în total 139 de probe (Fig. 1). Înainte de prelevare, nu au fost folosiți dezinfectanți vaginali sau dermici și spălarea sânilor nu a fost curățată. Toate probele prelevate au fost depozitate la -20 ° C imediat după prelevare.

diferitelor

Numărul și tipul de eșantioane prelevate de la perechi mamă-copil la fiecare dintre momentele indicate.

Imagine la dimensiune completă

Frotiurile bacterioscopice au fost făcute dintr-un eșantion de tampon vaginal separat, care a fost preluat de la fiecare mamă înainte de naștere. Probele au fost colorate conform lui Gram și evaluate conform metodei Nugent 7: 0-3 (normal), 4-6 (intermediar) și 7-10 (vaginoză bacteriană (BV)).

Profilarea comunității bacteriene

ADN-ul a fost extras folosind setul de izolare ADN MoBio PowerFecal (Mo Bio, Carlsbad, CA) conform instrucțiunilor producătorului. Cu toate acestea, au fost incluși pași suplimentari pentru diferite tipuri de eșantioane. Pe scurt, toate probele de tamponare au fost mai întâi agitate timp de aproximativ 10 minute în 750 μl de soluție salină tamponată cu fosfat steril (PBS). S-au adăugat 400 μl de probe de tampon în PBS și 800 μl de apă mamă la fiecare tub de margele uscate. 1 ml de lapte matern mamei a fost mai întâi centrifugat la 6.000 rpm timp de 20 de minute. Supernatanții au fost îndepărtați și fiecare peletă a fost resuspendată în 400 pl de PBS înainte de transferul în tuburi de margele uscate individuale. Tuburile au fost apoi centrifugate la 13.200 rpm timp de 30 de minute. Supernatanții au fost îndepărtați și procedura pentru setul de izolare a ADN-ului MoBio PowerFecal a fost urmată în etapa 2. ADN-ul din probele de scaun a fost extras conform protocolului producătorului. Probele reprezentând același tip de comunitate microbiană au format un singur lot de extracție de ADN. ADN-ul extras a fost stocat la -20 ° C înainte de analiză.

Amplificarea regiunii hipervariabile V1-V2 a ARNr-ului 16S a fost efectuată folosind coduri de bare ale primerilor universali 27F-YM și 357 R 8. Secvențele de amorsare au fost după cum urmează: 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNNNNNN AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3 '(Adaptor Illumina TruSeq. 3-end) și 5-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC TGC TGC CTY CCG TA-3 ′ (secvența adaptorului universal TruSeq și 357 R la capătul 3 ′). Condiții de amplificare incluse: 10 minute la 98 ° C, urmate de 5 cicluri de 30 s la 98 ° C, 30 s la 55 ° C și 45 s la 72 ° C, 30 de cicluri de 30 s la 98 ° C și 60 s la 72 ° C și o etapă finală de extensie la 72 ° C timp de 10 minute.

Reacțiile PCR au avut un volum total de 20 μl, cu 10 μl de Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, SUA), 5 μl de șablon ADN și fiecare primer la o concentrație de 0,2 μM. Produsele PCR au fost purificate folosind Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, California, SUA) și secvențiate cu sistemul Illumina MiSeq de la Centrul Genomului de la Universitatea din Tartu, Estonia (secvențierea cu un singur capăt folosind kitul MiSeq v2 și 300 de cicluri).

Analiza în timp real a bifidobacteriilor cu DGGE și PCR a fost efectuată folosind metodologia descrisă în metodele suplimentare.

Analiza datelor și statisticilor

Software-ul MOTHUR 1.27.0 a fost utilizat pentru a modifica, atenua și alinia secvențele obținute pentru a crea unități taxonomice operaționale (OTU) și pentru a atribui taxonomii. Secvențele au fost excizate și aruncate pe baza unui scor de calitate de 225 bp, respectiv. OTU-urile au fost generate utilizând un algoritm de grupare ierarhic contigu mediu cu un prag de identitate de 97%. Secvențele de referință pentru secvențele de gene ARNr 16S potrivite au fost obținute din baza de date ARN ribozomal SILVA și comparații cu atribuții taxonomice au fost făcute cu un clasificator bayesian viu cu o limită de încredere de 90%. OTU-urile cu mai puțin de două secvențe și OTU-urile prezente în mai puțin de două probe au fost, de asemenea, eliminate. Pentru a determina numele de specie cel mai probabil pentru OTU-uri pivot mapate la genul Lactobacillus, a fost efectuată o altă atribuire taxonomică la baza de date a secvenței de ARN ribozomal NCBI 16S cu BLASTN.

Toate analizele au fost efectuate folosind o corecție Holm-Bonferroni. Valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

Considerații etice

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de etică al cercetării de la Universitatea din Tartu (nr. 210T-7) și fiecare participant a primit consimțământul informat în scris la admiterea în departamentul de livrare. Toate metodele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările aplicabile.

Rezultatul

Profilarea comunității bacteriene utilizând secvențierea ARNr 16S

Un total de 1.106.448 citiri de secvență de înaltă calitate au fost generate în acest studiu. Limita pentru numărul minim de secvențe trunchiate atribuite eșantioanelor a variat de la 200 la 1400 în funcție de tipul de comunitate (Tabelul suplimentar S2). La aceste limite, curbele de diluare a cel puțin 90% din probe au atins un platou de 5%. Un total de 135 dintre aceste eșantioane și 1.530 OTU au depășit aceste valori limită și au fost analizate în continuare (numere de acces GenBank pentru secvențe OTU reprezentative: KP117311-KP118840). Un lapte matern, probele orale ale unei mame și două probe orale pentru sugari nu au depășit aceste limite. OTU-urile obținute au fost împărțite între 12 tulpini, 89 de familii și 170 de genuri.

Cele mai mari valori ale indicelui diversității Shannon au fost observate la nivelul intestinelor mamei și microbiozei orale, iar aceste comunități diferă semnificativ de intestinele și microbioza orală a sugarilor, care au avut o diversitate microbiană semnificativ mai mică (p

Grafic de corelație reprezentând valorile indicelui de similitudine al cosinusului între tipurile analizate de comunități microbiene. Punctele de timp reprezintă timpii de prelevare în raport cu nașterea copiilor.

Imagine la dimensiune completă

Scalarea multimetrică nemetrică (NMDS) trasează vizualizarea distanței Jaccard între eșantioanele tipurilor analizate de comunități microbiene.

Imagine la dimensiune completă

Numărul relativ al celor mai importante OTU-uri care au colonizat tipurile de comunități analizate.

Imagine la dimensiune completă

Microflora intestinală a sugarilor în timpul studiului nu a împărtășit nicio asemănare cu niciunul dintre tipurile de comunitate maternă analizate, dar s-a observat o similaritate mare între microbioza orală a sugarilor și microbioza care colonizează laptele matern, sânul și cavitatea bucală. cavități (Fig. 2). Aceste patru tipuri de comunități conțineau o combinație de OTU dominante aparținând predominant genului Streptococcus, care erau prezente în fiecare populație cu o incidență relativă similară (Fig. 4). Excepții au fost OTU-uri care au cartografiat genurile Staphylococcus și Propionibacterium. Aceste OTU au avut o abundență relativă scăzută (

Proporția de OTU observată în agregatele intestinale ( A ) și orală ( B ) a microorganismelor copilului împărtășite cu tipurile materne. * Intestinul și microbioza sugarilor la fiecare moment analizat au fost comparate cu microbioza vaginală observată la mame înainte de naștere.

Imagine la dimensiune completă

Proporția medie cu un interval de încredere de 95% OTU observat în intestin ( A ) la sugari și oral ( B ) microbioză care a fost împărtășită cu tipurile de comunitate a mamei sale (cota împărțită între perechi specifice mamă-copil). * Intestinul și microbioza sugarilor la fiecare moment analizat au fost comparate cu microbioza vaginală observată la mame înainte de naștere.

Imagine la dimensiune completă

Intestinele și microbioza sugarilor nu au prezentat o similitudine semnificativ mai mare cu comunitățile microbiene ale mamelor lor decât comunitățile microbiene ale altor mame și similitudinea nu s-a schimbat semnificativ în timpul studiului (Fig. 7 și Figura suplimentară S2).

Indicele mediu de similaritate între capre ( A ) și orală ( B ) prin microbioză și tipurile de comunități microbiene ale propriei mame (puncte roșii) și tipurile de comunitate observate în restul mamelor (Tukey boxplot).

Imagine la dimensiune completă

Compoziția sugarului și microbiota orală

Efectele confirmatorii au fost, de asemenea, semnificative în microbiota orală a sugarilor în timpul studiului (absocierea relativă medie [0, 8] [0, 16]) (Figura suplimentară S3). Nivelurile taxonomice inferioare au fost dominate de Streptococcaceae (0, 7 [0, 18]), urmate de Pasteurellaceae (0, 08 [0, 09]). Microbiota orală a sugarilor a fost relativ stabilă în timpul perioadei de studiu (Figura suplimentară S6-C) și a fost foarte similară la sugari.

În acest studiu, microbioza intestinală și orală a gemenilor din acest studiu nu a arătat o asemănare mai mare între acești frați pereche decât s-a observat la alți copii (medie [SD] CSI: 0,35 [0,38 vs. 0,32 [0,34] și 0,76 [0,24] ]). vs. 0,75 [0,22] pentru microflora intestinală și microbioza orală între gemeni comparativ cu alți copii). De asemenea, intestinele și microbiota orală a sugarilor născuți vaginal versus cezariană nu au prezentat o asemănare mai mare (0,22 [0,16] față de 0,35 [0,38] și 0,8 [0,82 vs. 0,73 [0,24].] Pentru microbiotii intestinali și orali la copiii născuți vaginal de Cezariana).

Compoziția comunităților microbiene care colonizează mamele

discuţie

Din câte știm, acesta este unul dintre primele studii care analizează efectul microbiozei materne asupra diferitelor părți ale corpului asupra intestinelor sugarilor și asupra microbiozei orale. Pe baza perechilor materne și infantile pe care le-am examinat, microbioza infantilă pare să conțină o comunitate microbiană puternică care seamănă puțin cu microbioza care colonizează intestinele mamei, țesutul vaginal, pielea, laptele matern și cavitatea bucală în primele șase luni de viață. viața copilului. În schimb, microbiota orală a sugarilor, precum și microbioza laptelui matern, microbioza glandei mamare și microbioza cavității bucale, erau foarte asemănătoare.

Abundența ridicată de Streptococcus OTU observată în comunitățile care colonizează laptele matern și cancerul mamar și prezența abundentă a Staphylococcus și Propionibacterium, care sunt colonizatori tipici ai pielii umane 13, în microbiomul laptelui matern (Figura Adițională S6) sugerează că poate apărea retrograd. în timpul alăptării, așa cum a anticipat Ansicar și colab. 9. Deoarece areolele mamare nu au fost eliminate înainte de prelevare, studiul poate supraestima similitudinea dintre microbioza orală la sugari și microbioza care colonizează areola mamară.

În comparație cu alte mame, nu am observat o similaritate mai mare a comunităților microbiene între sugari și mamele lor (Fig. 7). Acest lucru poate părea surprinzător având în vedere că mai multe studii anterioare au observat transmiterea de la mamă la copil a tulpinilor bacteriene 9, 10, dar cel mai probabil rezultatele noastre indică lipsa secvențierii genei 16S rRNA în identificarea taxonilor la un nivel inferior celui din genul 14. Astfel, rezultatele noastre în analiza compoziției comunităților la nivelul tulpinii nu exclud similitudini semnificative între perechile individuale de mame și sugari (și un model diferit de comunitate față de alte mame).

O altă limitare a acestui studiu a fost dimensiunea redusă a eșantionului, care este cel mai probabil motivul pentru care nu am observat efectul tipului de dozare și al regimului de hrănire asupra compoziției intestinelor și microbionilor la copii. Aceste efecte sunt bine descrise în multe studii anterioare [de ex. Referințe 6, 10]. Cu toate acestea, cel mai mare număr de taxoni bifidobacterieni a fost observat în microflora intestinală a gemenilor care au fost alăptați pentru perioade mai scurte și au primit în schimb o formulă prebiotică. Acest rezultat este în concordanță cu studiul lui Barrett și colab. 15, unde cel mai mare număr de tulpini bifidobacteriene și diversitate au fost observate la sugarii care primesc prebiotice cu formula (de exemplu, galactooligozaharide și polifructoză) 15 .

În concluzie, microflora intestinală a sugarilor sa dovedit a fi diferită de toate tipurile de comunitate maternă analizate în acest studiu, în timp ce microbiota orală a sugarilor a arătat o asemănare mare cu microbioza laptelui matern și a glandei mamare. Aceste rezultate evidențiază impactul semnificativ al contactului continuu dintre aceste comunități microbiene. Cu toate acestea, sa constatat că atât microbiota intestinală, cât și cea orală, au cea mai mare proporție de OTU cu tipul corespunzător de comunitate maternă. Diferența dintre similitudinea și proporția de OTU observată în microflora intestinală a sugarilor și mamelor poate fi legată de diversitatea mai mică a speciilor și, astfel, concurența mai mică în microflora intestinală a sugarilor, ducând la o diferență în abundența OTU comune.,

Mulțumiri

Mulțumim lui Heili Varendi și Anneli Aus de la Clinica pentru Copii a Universității din Tartu pentru asistența lor tehnică. Acest studiu a fost susținut de Consiliul Estonian pentru Cercetare (subvențiile nr. IUT34-19 și IUT34-16), Ministerul Eston al Educației și Cercetării (subvenția nr. KOGU-HUMB), Uniunea Europeană prin Fondul European de Dezvoltare Regională (reg. SFOS 3.2.0701.11-0023), Enterprise Estonia (subvenția nr. EU48695) și programul de inovare Orizont 2020 (WIDENLIFE, EU692065). Jaak Simm finanțează Consiliul de cercetare KU Leuven (GOA/10/09 MaNet, CoE PFV/10/016 SymBioSys) și subvenții de doctorat/postdoc de la guvernul flamand (IOF, Hercules Stitching, iMinds Medical Information Technologies SBO 2014). Finanțarea a fost asigurată și de Intel, Janssen Pharmaceutica și Institutul flamand pentru știință și tehnologie (IWT).

Material suplimentar electronic

Informatii suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.