microbiană

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Tempolul protejează șoarecii de obezitate și rezistența la insulină
  • Tempolul afectează microbioticele intestinale și activitatea BSH
  • Tempolul crește acizii biliari ai taurinei intestinale
  • T-P-MCA inhibă calea de semnalizare FXR
  • Întreruperea intestinală specifică a FXR reduce obezitatea
  • Tempolul îmbunătățește obezitatea prin inhibarea FXR intestinale
  • discuţie
  • metode
  • Substanțe chimice și reactivi
  • Studii pe animale
  • Pregătirea și cultura hepatocitelor primare
  • Analiza ARN
  • Testele luciferazei
  • Analize metabolice
  • Secvențierea genei ARNr 16S a microbiomului intestinal
  • Analiza datelor metagenomice
  • Analiza UPLC-ESI-QTOFMS
  • Prelucrarea datelor și analiza multidimensională a datelor
  • Activitatea BSH
  • Analiza datelor
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Semnalizare celulară
  • microbiom
  • Obezitatea
  • Terapeutică

abstract

Tempolul antioxidant reduce obezitatea la șoareci. Aici, demonstrăm că tempolul modifică microbiomul intestinal prin reducerea preferențială a genului Lactobacillus și a activității sale de hidrolază a sării biliare (BSH), ducând la acumularea acidului tauro-β-muricholic intestinal (T-P-MCA). T-P-MCA este un antagonist al receptorului nuclear al receptorului farnesoid X (FXR), care este implicat în reglarea metabolismului acidului biliar, lipidelor și glucozei. Nivelurile sale ridicate în timpul tratamentului cu tempol inhibă semnalizarea FXR în intestin. Șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi (Fxr AIE) hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi prezintă obezitate scăzută indusă de dietă, similar cu șoarecii de tip sălbatic tratați cu tempolo. Tratamentul cu tempol nu reduce în continuare creșterea în greutate la șoarecii FxrAIE, sugerând că FXR intestinal mediază efectele obezității cu tempol asupra obezității. Aceste studii demonstrează legătura biochimică dintre microbiom, semnalizarea receptorilor nucleari și tulburări metabolice și sugerează că inhibarea FXR intestinale ar putea fi vizată de medicamentele anti-obezitate.

Obezitatea a atins proporții epidemice globale și este asociată cu boli cronice precum diabetul zaharat de tip 2, bolile cardiovasculare, hepatosteatoza și cancerul 1. Obezitatea se dezvoltă ca urmare a aportului de energie care depășește cheltuielile de energie, ducând la stocarea netă a excesului de calorii sub formă de grăsime în țesutul adipos 2. O abordare farmaceutică ideală care suprimă pofta de mâncare, blochează absorbția grăsimilor din dietă sau promovează mobilizarea grăsimilor 3. S-a raportat că tempolul (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidină-1-oxil), un antioxidant și protecție împotriva radiațiilor 4,5, previne obezitatea la șoareci 6. Un studiu recent de metabolomică bazat pe spectrometrie de masă a arătat că tempolul a modificat nivelurile suspectate de microbi intestinali generați de microbi, oferind indicații inițiale că tempolul poate modifica compoziția microbiomului sau poate modifica potențialul metabolic al bacteriilor intestinale 7. În mod interesant, tempolul poate inhiba, de asemenea, efectele dăunătoare ale leziunii ischemice/reperfuzive asupra țesuturilor intestinale de șobolan, prevenind translocația bacteriană 8. Cu toate acestea, efectul tempolului asupra microbiomului intestinal nu a fost studiat.

Secvențierea genei ARN ribozomal 16S (16S rRNA) de mare viteză a populațiilor microbiene intestinale și metabolomica bazată pe spectrometrie de masă sunt instrumente eficiente pentru caracterizarea microbiomului intestinal și a metaboliților în matricile biologice, respectiv. 9, 10. Se știe că perturbarea echilibrului microbionului intestinal în intestin poate afecta diferite căi metabolice in vivo, cum ar fi metabolismul acizilor grași și al acizilor biliari 11. Acest lucru poate contribui la constatarea că tulpina Firmicutes și tulpina Bacteroidetes, cele două populații predominante de microbiote atât la șoareci, cât și la oameni, s-au schimbat la șoarecii obezi comparativ cu animalele slabe 12. S-a emis ipoteza că căsătoria, secvențierea, metagenomica și metabolomica 16S ARNr pot arunca lumină asupra interacțiunii dintre gazdă și cei 100 trilioane de microbi găsiți în intestin 13. Până în prezent, cu toate acestea, au existat studii limitate care utilizează aceste abordări de mare viteză pentru a identifica potențiale ținte pentru tratamentul obezității și rezistenței la insulină.

În studiul de față, o combinație de secvențierea genei 16S rARN și metabolomică bazată pe spectrometrie de masă a fost utilizată pentru a examina modificările microbiomului intestinal și a metaboliților într-un model de șoarece cu conținut ridicat de grăsimi (HFD) tratat cu tempol. Mai mult, șoarecii Fxr-Null (Fxr AIE) specifici intestinului au fost folosiți pentru a investiga mecanismul prin care microbiomul intestinal afectează obezitatea și rezistența la insulină. Acest studiu demonstrează că tempolul reduce obezitatea și rezistența la insulină prin remodelarea microbiotei intestinale, ducând la o modificare a compoziției acidului biliar și la inhibarea asociată a semnalizării receptorului farnesoid X (FXR).

Rezultatul

Tempolul protejează șoarecii de obezitate și rezistența la insulină

Tempolul afectează microbioticele intestinale și activitatea BSH

( A ) Curbele tipice de creștere ale șoarecilor menținute pe HFD. n = 5 șoareci per grup. ( b ) raportul dintre greutatea grăsimii și greutatea slabă a șoarecilor după 6 săptămâni de HFD. n = 5 șoareci per grup. c ) GTT și zona sub curba HFD de 7 săptămâni. n = 5 șoareci per grup. d ) ITT 13 săptămâni HFD. n = 5 șoareci per grup. e ) Glucoza de post, insulina serică de post și indicele modelului de homeostazie HFD de 14 săptămâni. n = 5 șoareci per grup. Toate datele sunt prezentate ca medie ± sd, ANOVA, urmată de testul Student de două pagini. * P fl/fl .

Imagine la dimensiune completă

Tempolul îmbunătățește obezitatea prin inhibarea FXR intestinale

A ) Curbele de creștere ale șoarecilor Fxr fl/Fl vehicul și tempolo și șoarecilor Fxr AIE pe HFD. n = 4-5 șoareci per grup. b ) Compoziția corpului prin RMN pentru a afișa raportul de masă grasă (stânga) și raportul grăsime/slab (dreapta) la șoarecii tratați cu vehicul și tempol după 13 săptămâni de HFD. n = 4-5 șoareci per grup. ( c ) GTT și zona de sub curbă după 5 săptămâni de șoareci tratați cu templari pe HFD. n = 4-5 șoareci per grup. d ) ITT după 6 săptămâni de HFD. n = 4-5 șoareci per grup. e ) Glucoza de post, insulina serică de post și indicele de evaluare al modelului de homeostazie după tratamentul cu tempol pe HFD timp de 16 săptămâni. n = 5 șoareci per grup. Toate datele sunt prezentate ca medie ± sd, ANOVA urmată de ANOVA unidirecțională cu testul lui Tukey. * P 7. La un model de șobolan cu ocluzie excelentă a arterei mezenterice, tratamentul cu tempol a prevenit efectele dăunătoare ale leziunii ischemiei/reperfuziei asupra țesuturilor intestinale prin reducerea translocației bacteriene 8. Aceste rezultate oferă dovezi suplimentare că tempolul poate afecta microbiomul.

FXR joacă un rol cheie în metabolismul acizilor biliari, lipidelor și glucozei. Șoarecii Fxr -/- au crescut intoleranța la glucoză în dietă 33 și agoniștii FXR au îmbunătățit sensibilitatea la insulină într-un model genetic de obezitate 34. Cu toate acestea, alte studii au sugerat că șoarecii Fxr -/- au îmbunătățit homeostazia glucozei și că agoniștii FXR au exacerbat tulburările metabolismului lipidelor și rezistența la insulină la modelele obeze de șoarece 35, 36. Aceste dovezi contradictorii pentru un rol al FXR în patogeneza tulburărilor metabolice se pot datora semnalizării FXR în ficat, spre deosebire de acest studiu, care implică FXR intestinal. În plus, diferențele în microbiota intestinală ar putea explica rezultatele experimentale de mai sus. Prezentul studiu oferă dovezi care susțin opinia că inhibarea FXR intestinală atât în ​​modelul de ablație genetică al șoarecilor Fxr AIE, cât și în șoarecii tratați cu tempol îmbunătățește obezitatea indusă de dietă și rezistența la insulină.

Deși mecanismul complet prin care semnalizarea FXR intestinală afectează obezitatea nu este pe deplin stabilit, lipidomica a relevat că serul C14, C18, C18: 1, C20: 4 SM și raportul dintre ceramidă și S1P în Fxr AIE și șoareci tratați cu tempol sunt numeroase studii în ultimul deceniu susțin rolul SM și al metaboliților săi în patogeneza tulburărilor metabolice asociate cu obezitatea 22. SM poate fi metabolizat în ceramidă, sfingozină și S1P 37. Ceramida activează protein kinaza C, kinaza N-terminală c-jun și inhibă transmiterea căii de semnalizare a insulinei în țesuturile țintă ale insulinei periferice, cum ar fi ficatul și țesutul adipos 38. S1P a fost raportat pentru a contracara efectele ceramidei. S-a demonstrat că un raport crescut de ceramidă și SIP contribuie la rezistența la insulină și la obezitate 39. Dacă aceasta este principala modalitate de a media efectele tempolului și FXR asupra obezității necesită investigații suplimentare.

Pe scurt, metagenomica și metabolomica au arătat că inhibarea semnalizării FXR intestinale prin tratamentul cu tempol a fost asociată cu o scădere a activității Lactobacillus și a activității sale BSH. Acumularea de T-P-MCA în intestin a fost însoțită de inhibarea FXR. Un studiu recent care a folosit șoareci fără bacterii a arătat că T-P-MCA ar putea inhiba semnalizarea FXR in vivo în intestin 21. Acest lucru susține studiile in vitro raportate aici. Constatarea că tempolul a îmbunătățit obezitatea prin inhibarea semnalizării FXR intestinale sugerează că FXR intestinal ar putea acționa ca o potențială țintă clinică în tratamentul obezității.

metode

Substanțe chimice și reactivi

Templul a fost cumpărat de la Sigma (St. Louis, MO). Acizii biliari au fost comandați de la Steraloid, Inc. (Newport, RI) și Sigma și TCA-d5 sodiu provin de la Toronto Research Chemicals Inc. (Toronto, Ontario). SM și ceramide au fost obținute din lipide polare Avanti. Kitul S1P ELISA a fost achiziționat de la Echelon Biosciences Inc. (Salt Lake City, UT). Trusa de acid biliar a fost achiziționată de la Catachem, Inc. (Oxford, CT). Toți solvenții și reactivii organici au fost de cea mai bună calitate disponibilă.

Studii pe animale

Pregătirea și cultura hepatocitelor primare

Hepatocitele au fost preparate prin metoda generală de perfuzie 41. Hepatocitele primare de la șoareci C57BL/6N de 6 săptămâni au fost obținute prin perfuzie de colagenază 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Celulele au fost purificate cu centrifugare cu densitate de 45% percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) și cultivate în DMEM (Invitrogen) cu 10% ser fetal bovin și 1% insulină-transferină-seleniu-etanolamină (Invitrogen). Viabilitatea hepatocitelor a fost determinată folosind excluderea colorantului albastru trypan și au fost utilizate cele cu viabilitate mai mare de 85%. Mediul a fost schimbat în DMEM cu 1% ser fetal bovin după cultivare timp de 4 ore. După înfometare timp de 4 ore, celulele au fost expuse la tempol/TCA/T-β-MCA/TCDCA/TUDCA/CDCA timp de 24 de ore.

Analiza ARN

Mucoasa intestinului a fost răzuită ușor și înghețată rapid în azot lichid și depozitată la -80 ° C până când ARN-ul a fost preparat. ARN-ul a fost extras din intestinul înghețat folosind reactiv TRIzol (Invitrogen). ADN-ul complementar a fost sintetizat din 1 μg de ARN total folosind transcriptaza inversă Superscript II (Invitrogen). Primerii qPCR au fost proiectați cu qPrimerDepot și secvențele sunt prezentate în tabelul suplimentar S1. qPCR a fost realizat utilizând mixul master SYBR PCR verde într-un sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Nivelurile de ARNm măsurate au fost normalizate la cele ale ARN ribozomal 18S și exprimate ca schimbare de ori față de cele ale grupului de control.

Testele luciferazei

Grace Guo (Universitatea Rutgers) a furnizat construcția luciferază licurică PGL4-Shp-TK și plasmida de expresie Fxr umană. Paul A. Dawson (Școala de Medicină a Universității Wake Forest) a furnizat plasmida de expresie Asbt umană. Plasmidele au fost transfectate în celule Caco2 (ATCC HTB-37) folosind reactivul de transfecție ADN X-tremeGENE HP (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Celulele au fost lizate și activitățile luciferazei au fost măsurate cu un kit de testare Dual-Luciferază (Promega, Madison, WI). Activitatea luciferazei cu licurici a fost normalizată la activitatea luciferazei Renilla.

Analize metabolice

Pentru GTT, șoarecii au fost posti 16 ore, sângele a fost extras și șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 1 g kg -1 glucoză. Pentru ITT, șoarecii au fost în jeș timp de 4 ore, sângele a fost extras și apoi injectat intraperitoneal cu insulină (Eli Lilly, Washington, DC) 1 U kg -1 greutate corporală. Probele de sânge au fost prelevate din coadă la 15, 30, 60 și 90 de minute după injectare, iar glucoza a fost măsurată folosind un glucometru (Bayer, Pittsburgh, PA). Insulina serică postită a fost măsurată folosind un kit de testare imunosorbant legat de enzime (Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL).

Secvențierea genei ARNr 16S a microbiomului intestinal

Bacteriile din conținut de fecale și caecum au fost extrase folosind PowerSoil ADN Kit de izolare (Mo Bio laborator, Inc., Carlsbad, CA). Produsele PCR (

1.000 bp) au fost purificate utilizând tehnologia AgencourtAMPure (Beckman Coulter, Brea, CA) așa cum este descris în 454 Buletinul tehnic numărul 2011-002, Procedura de îndepărtare a fragmentelor scurte. După purificare, produsele au fost cuantificate atât de Qubit (Lifetech, Carlsbad, CA), cât și de qPCR, folosind KAPA Biosystems Library Quantification Kit (KapaBiosystems, Woburn, MA). Produsele au fost combinate pe baza cantităților molare, au rulat pe un gel de agaroză 1% și au fost extrase. După curățare cu un kit QIAquick PCR Purification (Qiagen, Valencia, CA), calitatea și cantitatea au fost evaluate utilizând un ADN 7500LabChip pe Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) și cuantificarea Qubit. Secvențierea a fost efectuată folosind un sfert Picotiter Plate pe un 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX + (Roche Diagnostics). qPCR a fost realizat utilizând mixul master SYBR PCR verde într-un sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Condițiile PCR au fost de 50 ° C timp de 2 minute; 95 ° C timp de 10 minute; 40 de cicluri de 95 ° C pentru 15S; și 60 ° C timp de 1 min.

Analiza datelor metagenomice

Setul experimental a constat din 14 eșantioane distribuite ca 6 replici ale vehiculului și 8 replici de gavaj cu tempol. După filtrarea și deduplicarea calității, fiecare eșantion conține în medie 11 000 de citiri. Pachetul software mothur 42 a fost folosit pentru preprocesarea datelor de secvențiere și Ribosomal Database Project multi-clasificator 43 pentru a atribui fiecare secvență unui rang taxonomic. Preprocesarea a constat în filtrarea citirilor pentru o calitate medie de 20, eliminarea secvențelor duplicate și împărțirea în probe prin coduri de bare, permițând în același timp o nepotrivire în codul de bare. Un instrument statistic personalizat care utilizează analiza varianței (ANOVA) cu design de tratament factorial detectează ranguri taxonomice care arată schimbări semnificative statistic între probe. Pentru a ține cont de diferențele în totalul citirilor pe eșantion, clasificările au fost convertite în procente din totalul citirilor. Această abordare a permis apoi comparații exacte în cadrul și între grupuri.

Analiza ANOVA cu design de tratament factorial a fost introdusă pentru a detecta bacteriile care s-au schimbat semnificativ în număr.

Modelul complet se numește modelul efectelor fixe.

Tratamente tempol și vehicul

Studiu: studiul 1, studiul 2 (re-secvențierea studiului 1)

Ipoteza: bacteriile sunt neschimbate sub diferite doze.

cu i = 1, 2, 3; j = 1, 2; k = 1, 2, 3, 4

cu i = 1, 2, 3; k = 1, 2, 3, 4

Modelul complet tratează cele două studii (studiul 1 și studiul 2) ca un bloc pentru a vedea mai întâi dacă există un efect de „studiu”. Dacă efectul „studiu” este semnificativ, studiile sunt păstrate separat în problemă ca efect bloc 42. Dacă nu, este eliminat și combinat cu date din două studii 43. În cele din urmă, corecția Šidák a fost folosită pentru corectarea valorii P.

Analiza UPLC-ESI-QTOFMS

Prelucrarea datelor și analiza multidimensională a datelor

Datele brute au fost aliniate utilizând software-ul MarkerLynx (Waters Corp.) pentru a genera o matrice de date formată din zone de vârf corespunzătoare unui m/z unic și timp de retenție fără normalizare. Analiza metabolomicii, inclusiv analiza componentelor principale și modelele PLS-DA, a fost efectuată cu SIMCA-P + 12 (Umetrics, Kinnelon, NJ) 44. Ionii cu o corelație de ~ 0,8 la model au contribuit semnificativ la separarea dintre grupul de control și grupul tratat cu tempol.

Activitatea BSH

Proteinele fecale au fost preparate din proba fecală (0,5 g) în pH 7,4 PBS (5,0 ml) folosind sonicarea 45. Activitatea BSH a fost măsurată pe baza generării de CDCA din TCDCA în fecale. Pe scurt, incubația a fost efectuată în 3 mM tampon acetat de sodiu, pH 5,2, conținând 0,1 mg ml -1 proteină fecală și 50 μM TCDCA-d5 într-un volum final de 200 μl. După o incubare de 20 de minute la 37 ° C, reacția a fost oprită prin introducerea probelor în gheață uscată. O sută de microlitri de metanol au fost adăugați direct la amestecul de reacție de 100 pl. După centrifugare la 14, 000 × g timp de 20 de minute, 5 μl de supernatant au fost transferate într-un flacon de eșantionare automată supus analizei printr-un sistem UPLC cuplat cu un spectrometru de masă XEVO triplu quadrupol tandem (Waters Corp.).

Analiza datelor

Valorile experimentale sunt prezentate ca medie ± sd, analiza statistică a fost efectuată folosind testul t cu două cozi Student și ANOVA unidirecțională cu testul lui Tukey și respectiv testul lui Dunnett. Valorile P