controlează

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Expresia EcSOD este absentă în HMEC cultivat 2D
  • Expresie Gena EcSOD este reactivată în HMEC cultivată în 3D
  • HMEC de cultură 3D prezintă niveluri mai scăzute de oxidare DCFH comparativ cu celulele din cultura monostrat
  • Tăcere Gena EcSOD în HMEC cultivat în 2D este asociată cu hipermetilarea ADN-ului promotor
  • Expresia EcSOD este semnificativ redusă în țesuturile clinice ale cancerului de sân și nivelurile sale de expresie a ARNm corelate invers cu stadiul clinic
  • Reexprimarea EcSOD a inhibat formarea coloniilor stelate de celule de cancer mamar în cultura 3D
  • Supraexpresia EcSOD a suprimat metastazele pulmonare experimentale ale celulelor MDA-MB231 și supraviețuirea prelungită a animalelor
  • EcSOD a redus rata metastazării spontane a celulelor adenocarcinomului mamar de șoarece într-un model de șoarece simgenic
  • discuţie
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Figura suplimentară 1

obiecte

  • Cancer mamar
  • Metilarea ADN-ului
  • metastaze
  • oxidoreductaza

abstract

Expresia modificată a enzimelor antioxidante celulare care metabolizează speciile reactive de oxigen (ROS) este adesea afectată în cancerele umane. 1, 2, 3, 4 Astfel de enzime antioxidante includ SOD (superoxid dismutaze), care îndepărtează superoxidul (O 2 -) și catalazele, și glutation peroxidazele, care neutralizează peroxidul de hidrogen (H 2 O 2). Eliminarea deteriorată a ROS duce la un mediu prooxidativ care favorizează proliferarea crescută, supraviețuirea și progresia oncogenă în celulele canceroase. 1, 5 Am demonstrat recent că expresia extracelulară superoxid dismutază (EcSOD) este suprimată în mod semnificativ prin metilarea ADN-ului aberant în aproximativ 80% din cancerele pulmonare comparativ cu țesuturile pulmonare normale. 6 Metilarea ADN-ului este unul dintre mecanismele epigenetice asociate cu expresia genelor aberante a genelor supresoare tumorale. 7 Deoarece EcSOD este singurul eliminator de oxigen din plămâni, creșterea rezultată a stresului oxidativ în microambientul tumoral ca urmare a acestei inactivări a expresiei EcSOD este de așteptat să contribuie la progresia patologică și malignă a cancerului pulmonar.

Comparativ cu alte SOD de mamifere care sunt exprimate omniprezent, expresia genei EcSOD este strict controlată de tipul celulei și de maniera specifică țesutului. 8 Datorită suprafeței celulare și localizării extracelulare a EcSOD versus distribuția citosolică și mitocondrială a CuZnSOD și MnSOD, modelul specific al expresiei EcSOD subliniază rolurile biologice diferite ale acestor SOD în țesuturi. În studiul nostru anterior privind cancerul de sân, supraexprimarea EcSOD în liniile celulare de cancer de sân EcSOD-zero a condus la fenotipuri maligne atenuate in vitro, inclusiv rata scăzută de creștere, supraviețuirea clonogenă și invazia9, sugerând funcția supresivă a EcSOD în cancerul de sân. Pentru a înțelege mai bine rolul EcSOD în menținerea homeostaziei redox a celulelor epiteliale mamare normale la sân și în prevenirea tumorigenezei mamare mediată prin oxidare, este necesar să se evalueze nivelurile de expresie ale acestei enzime antioxidante în celulele epiteliale mamare normale versus celulele maligne. celulele epiteliale mamare 6 au ridicat întrebarea fundamentală dacă EcSOD este exprimat în celulele epiteliale mamare normale.

Pentru a aborda în continuare această problemă cu expresia EcSOD în celulele epiteliale normale ale sânului, am efectuat colorare imunohistochimică (IHC) și acum am confirmat expresia EcSOD în celulele epiteliale ale sânilor în țesutul mamar uman normal, spre deosebire de studiul anterior in vitro folosind celule cultivate. Această discrepanță sugerează că expresia EcSOD ar putea fi întreruptă atunci când celulele au fost cultivate ca monostrat într-un sistem convențional de cultură bidimensională (2D). Utilizarea unui sistem de cultură tridimensională (3D) a câștigat recent impuls în studiile de cancer mamar, deoarece oferă o condiție de cultură tisulară relevantă din punct de vedere fiziologic pentru recapitularea multor caracteristici histologice ale epiteliului mamar in vivo. Acestea includ formarea de sferoide asemănătoare acinei cu lumen gol, polarizarea apicală a celulelor și depunerea bazală a componentelor membranei bazale, precum și imagistica expresiei genelor asociate în mod specific cu funcția mamară. 10, 11

Scopul acestui studiu a fost, prin urmare, de a determina expresia EcSOD în celulele epiteliale ale sânului non-malign, utilizând un sistem de cultură 3D relevant fiziologic și de a determina mecanismele care stau la baza diferențelor în expresia genei EcSOD în cultura monostrat versus cultura acinară ca și în cazurile de cancer de sân uman dobândite clinic. . Am constatat că organizarea țesuturilor a fost esențială pentru expresia genei EcSOD în celulele epiteliale mamare mamare non-maligne și că reactivarea expresiei genei EcSOD în celulele cultivate 3D a fost asociată cu reprogramarea epigenetică. În plus,> 80% din tumorile mamare examinate au arătat niveluri semnificativ reduse de expresie EcSOD comparativ cu țesuturile mamare normale. Am arătat în continuare că scăderea expresiei EcSOD în aceste tumori mamare a fost asociată cu hipermetilarea ADN-ului în regiunea de reglementare a promotorului EcSOD. În modelele noastre metastatice in vivo, animalele tratate cu un vector adenoviral care supraexprimă EcSOD uman, AdEcSOD, au arătat o reducere semnificativă a metastazelor pulmonare experimentale și a metastazelor spontane comparativ cu șoarecii goi tratați cu vector.

Din câte știm, acesta este primul studiu care arată „plasticitatea” expresiei genei EcSOD în celulele epiteliale mamare umane non-maligne (HMEC) cu o viabilitate finită în condiții de cultură 3D versus celule 2D. Asocierea silențierii genei EcSOD cu pierderea organizării țesutului mamar in vivo sugerează un rol important pentru EcSOD ca supresor al tumorii mamare. Prin urmare, în definirea de noi intervenții terapeutice pentru această boală, va fi important să se definească în continuare importanța și rolul mecanic al EcSOD în suprimarea progresiei cancerului de sân.

Rezultatul

Expresia EcSOD este absentă în HMEC cultivat 2D

Pentru a determina rolul EcSOD în dezvoltarea cancerului de sân, am evaluat nivelurile de expresie EcSOD în celule epiteliale mamare cultivate non-maligne. Așa cum se arată în Figura 1a, expresia ARNm EcSOD nu a fost detectabilă nici în celulele HMEC, nici în celulele MCF-10A, comparativ cu fibroblastele MRC5 pulmonari umani și culturile primare de celule epiteliale ale căilor respiratorii umane. Cu toate acestea, colorarea IHC a relevat o colorare pozitivă definitivă a EcSOD în țesuturile mamare normale, în special în epiteliul glandei mamare a sânilor (Figura 1b). Aceste observații sugerează că, deși celulele epiteliale mamare normale au demonstrat o expresie robustă a EcSOD in vivo, cultivarea celulelor in vitro a dus la pierderea expresiei genei EcSOD.

Expresia EcSOD este detectabilă în țesutul mamar normal, dar nu și în celulele epiteliale din lapte non-maligne în culturile monostrat. A ) ARN-ul total a fost extras și analizat pentru transcrierea mARN-ului EcSOD din HMEC post-stazică derivat din mamoplastele reducătoare și din linia celulară epitelială mamară non-malignă transformată spontan MCF-10A. Comparativ cu fibroblastele pulmonare umane normale (MRC5) și celulele epiteliale ale căilor respiratorii umane normale, celulele HMEC și MCF-10A au arătat expresia mRNA EcSOD nedetectabilă, determinată de analiza RT-PCR în timp real. 18S a fost folosit ca control de încărcare. Barele de eroare reprezintă aici, n = trei experimente separate. b ) Analiza IHC arată o colorare pozitivă a EcSOD în țesutul mamar normal (panoul din dreapta). Panoul din stânga prezintă colorarea H și E a aceluiași țesut mamar normal.

Imagine la dimensiune completă

Expresia genei EcSOD este reactivată în HMEC cultivat în 3D

Imagine la dimensiune completă

HMEC de cultură 3D prezintă niveluri mai scăzute de oxidare DCFH comparativ cu celulele din cultura monostrat

Pentru a determina dacă nivelurile de stres oxidativ se modifică atunci când HMEC-urile sunt cultivate în condiții 2D în comparație cu cultura 3D, am etichetat celulele cu o sondă fluorescentă sensibilă la oxidare, DCFH. A fost observată o creștere a oxidării DCFH în HMEC cultivat în 2D comparativ cu celulele cultivate în 3D, după cum se arată în analiza citometriei în flux din Figura 3a (intensitatea medie a fluorescenței 2102 în HMEC 2D vs. 189 în HMEC 3D). Versiunea insensibilă la oxidare a acestei sonde, care controlează absorbția coloranților, clivajul esterazei și efluxul, nu a arătat nicio diferență în intensitatea semnalului, indicând faptul că diferențele de semnal observate între culturile 2D și 3D s-au datorat în mod specific oxidării sondei (datele nu sunt prezentate). Acest lucru sugerează că proliferarea celulelor epiteliale mamare ne-maligne ca cultură monostrat a dus la stres oxidativ crescut, care ar putea fi atribuit în parte pierderii expresiei EcSOD.

Imagine la dimensiune completă

Tăcerea genei EcSOD în HMEC cultivat în 2D este asociată cu hipermetilarea ADN-ului promotor

Expresia EcSOD este redusă semnificativ în țesuturile clinice ale cancerului de sân și nivelurile sale de expresie a ARNm corelate invers cu stadiul clinic

De asemenea, am căutat să determinăm nivelurile de expresie EcSOD în probele clinice de cancer de sân. Așa cum se arată în imaginile reprezentative ale colorării EcSOD IHC din Figura 4a, am detectat o expresie puternică și definitivă a proteinei EcSOD în celulele epiteliale mamare din lobulul benign. În schimb, imunoreactivitatea EcSOD este redusă semnificativ în carcinomul cu ductal in situ și în cancerul de sân invaziv. Intensitatea colorării IHC pentru EcSOD în țesuturile mamare normale față de cele neoplazice a fost semi-cuantificată și prezentată în Tabelul 1. Pentru a investiga în continuare dacă expresia EcSOD afectată este un eveniment comun în cancerul de sân, am efectuat un câmp ADNc pentru cancerul de sân TissueScan (Origene, Inc ., Rockville, MD, SUA). Așa cum se arată în Figura 4b, a existat o scădere a nivelurilor de expresie a mRNA EcSOD în stadiul I și o scădere semnificativă în stadiile II-IV în comparație cu țesuturile normale

Supraexprimarea EcSOD a inhibat formarea coloniilor stelate de celule MDA-MB231 în cultura 3D. MDA-MB231 de cultură bidimensională au fost infectate cu AdEmpty, AdEcSOD sau AdAHBD, la moi = 50 PFU/celulă timp de 24 de ore, urmate de reîncărcarea celulelor în cultură 3D. După 5 zile de cultură 3D, celulele MDA-MB231 au format colonii mari cu structuri stelate extinse, un semn distinctiv al fenotipului tridimensional al cancerului de sân „invaziv”. Deși AdEmpty nu a afectat morfologia 3D a acestei linii celulare, supraexprimarea EcSOD, atât formele de lungime completă, cât și formele trunchiate (cu infecție cu AdEcSOD și AdAHBD adenovirus, moi = 50 PFU/celulă), au dus la colonii mult mai mici lipsite de formare Un 3D similar modificarea morfologică a fost observată atunci când celulele MDA-MB231 au fost generate pentru a exprima stabil EcSOD, la Ec.20 (lungime completă) și AHBD.3 (ștergere în HBD), unde celulele au format colonii mici în absența alungirii stelelor. Micrografii reprezentative N = 3. Scala coloanei = 100 μm.

Imagine la dimensiune completă

Supraexpresia EcSOD a suprimat metastazele pulmonare experimentale ale celulelor MDA-MB231 și supraviețuirea prelungită a animalelor

Suprimarea metastazelor pulmonare de către celulele MDA-MB231.luc de către EcSOD. Pentru a induce metastaze pulmonare, 2 x 106 celule MDA-MB231.luc au fost injectate în vena laterală a cozii la șoareci nudiți atimici. Supraexprimarea EcSOD a fost realizată cu AdEcSOD sau AdAHBD (1 x 10 10 PFU) administrat intramuscular cu 3 zile înainte de injectarea celulelor canceroase la sân. AdEmpty a fost folosit ca control vector. ( A, Panoul superior) Imagini reprezentative bioluminescente ale șoarecilor luate imediat după injectarea celulelor MDA-MB231.luc. ( A, Panou inferior) Șoarecii au fost imaginați dorsal și ventral săptămânal pentru a monitoriza metastazele celulare ale cancerului de sân. Grupurile tratate cu EcSOD au arătat o dezvoltare redusă a metastazelor pulmonare comparativ cu grupul infectat cu AdEmpty. Iată imagini cu cursul timpului de la același animal din fiecare grup. ( b ) Semnalul luminiscent (flux de fotoni) al celulelor metastatice MDA-MB231.luc a fost reprezentat grafic în timp, arătând o inhibare semnificativă a metastazelor pulmonare de către AdEcSOD și AdAHHD versus AdEmpty (P

Inhibarea metastazelor spontane ale liniei celulare de carcinom mamar de către EcSOD. A ) Imagini reprezentative de bioluminiscență care prezintă progresia celulelor carcinomului mamar de șoarece 4T1.luc la șoareci BALB/c în ziua 10 după implantarea tumorii (1), 7 zile după îndepărtarea tumorii (2) și metastaze ale plămânilor și ganglionilor limfatici la 4 săptămâni după tumoră îndepărtare (3).). b ) Apariția metastazelor celulelor 4T1.luc la siturile secundare (plămâni și ganglioni limfatici) a fost evaluată și prezentată ca procent de metastaze. ( c ) Ratele de supraviețuire Kaplan-Meier ale animalelor transduse cu AdEmpty, AdEcSOD și AdAHBD au fost reprezentate grafic folosind statistici Prism cu zile trecute după îndepărtarea chirurgicală a tumorilor primare 4T1.luc. Curba de supraviețuire pentru AdEcSOD și AdAHBD a diferit semnificativ (P 15, care ulterior a sugerat că SOD secretat poate juca un rol important în menținerea stabilității proteinelor din lapte prin prevenirea deteriorării proteinelor oxidative. 16 Aici am demonstrat în mod convingător expresia EcSOD în glanda mamară normală umană și celulele epiteliale sunt probabil o sursă de excreție a acestei enzime în lapte.

Am arătat în plus că HMEC pierde expresia EcSOD atunci când este cultivat ca monostrat și această schimbare este reglementată de un mecanism epigenetic în care metilarea regiunii ADN promotor EcSOD are loc în HMEC cultivat 2D (Figura 3d). Hipermetilarea insulelor CpG în regiunea promotoră a genei este recunoscută ca un important mecanism epigenetic de reducere a silențierii transcripționale a genelor reglatoare ale tumorii, în multe cazuri gene supresoare tumorale, în timpul dezvoltării cancerului. Faptul că expresia genei EcSOD este strict controlată într-o manieră specifică tipului de celulă 8 și promotorul său prezintă o structură CpG similară cu o altă genă redusă la tăcere prin metilarea aberantă a citozinei 18 sugerează o posibilă asociere a reglării epigenetice prin metilarea ADN-ului cu EcSOD genă. expresie în celulele epiteliale ale laptelui. Atenuarea genei EcSOD prin metilarea ADN-ului este un proces reversibil, cum ar fi morfogeneza acrară mediată de reactivarea indusă de lrECM HMEC a expresiei genei EcSOD în HMEC cultivat în 3D.

Este important de reținut că modelul HMEC utilizat în acest studiu a fost obținut dintr-o sursă comercială care a suferit stază sau îmbătrânire indusă de stres. 19 Deși aceste post-staze HMEC au încă o durată de viață limitată și nu sunt maligne, s-a demonstrat că au dobândit sute de modificări transcripționale și epigenetice în timpul procesului de selecție. 20, 21 Acest lucru sugerează că pierderea expresiei EcSOD observată în HMEC-ul nostru cultivat 2D poate fi inițiată în timpul progresiei celulare prin această provocare de stază și că celulele pre-stază pot păstra în continuare expresia EcSOD.

Observația că pierderea țesutului din lapte (la fel ca în cultura monostrat HMEC) a promovat reducerea epigenetică a EcSOD este, de asemenea, puternic susținută și este reflectată îndeaproape în datele noastre clinice, majoritatea tumorilor mamare prezentând niveluri semnificativ reduse ale expresiei EcSOD comparativ cu țesutul mamar normal. Regiunea analizată prin analiza COBRA (Figura 4c) corespunde site-ului de reglementare pentru factorii de transcripție SP1/SP3, care s-au dovedit a conduce la expresia EcSOD și pe care am descoperit-o recent că sunt hipermetilate în studiile noastre de cancer pulmonar. Metilarea siturilor CpG din această regiune interferează cu legarea acestor factori de transcripție și creează o structură de cromatină mai închisă, ducând la o stare represivă a expresiei EcSOD.

În general, acest studiu demonstrează în mod clar expresia EcSOD în celulele epiteliale mamare mamare normale in vivo și în HMEC de cultură 3D. Cu toate acestea, dacă arhitectura lobulară este întreruptă, de exemplu în tumorile mamare și în monostratul cultivat cu HMEC, gena EcSOD este redusă la tăcere prin metilarea aberantă a citozinei. Aceste observații interesante sugerează, de asemenea, că activitatea crescută de absorbție a ROS, de exemplu, cu mimetice SOD, ar putea fi explorată ca o strategie terapeutică pentru cancerul de sân metastatic. Validarea ulterioară a rolului cauzal al mutării genei EcSOD în promovarea progresiei și metastazării cancerului de sân va fi, prin urmare, esențială în identificarea pierderii expresiei EcSOD ca biomarker predictiv pentru diagnosticarea precoce și tratamente noi.