specifică

  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Materiale și metode suplimentare
  • Tabelele legendelor suplimentare
  • Legende de imagine suplimentare
  • Fișiere Excel
  • Tabel suplimentar 1
  • Tabelul suplimentar 2
  • Fișiere imagine
  • Figura suplimentară 1
  • Figura 2 suplimentară
  • Figura 3 suplimentară

TRAF3, o proteină adaptor citoplasmatică, a fost recent identificată ca un candidat supresor tumoral într-un număr de neoplasme umane cu celule B umane. Delețiile homozigote și mutațiile inactivante ale genei Traf3 au fost detectate în limfomul non-Hodgkin, incluzând limfomul din zona marginală splenică (MZL), leucemia limfocitară cronică cu celule B, limfomul cu celule de manta, precum și mielomul multiplu și macroglobulinemia Waldenström. 1, 2, 3, 4 Cu toate acestea, indiferent dacă delețiile sau mutațiile TRAF3 joacă un rol cauzal în limfomageneza B, un studiu ulterior in vivo cu șoareci knockout TRAF3 este în așteptare.

Recent am creat o alelă condiționată cu pierderea funcției genei Traf3 care permite ștergerea specifică a TRAF3 în celulele B la șoareci (șoareci B-TRAF3 -/-). 5 Acești șoareci prezintă populații foarte răspândite de celule B în organe limfoide secundare datorită supraviețuirii remarcabil prelungite a celulelor B mature independente de BAFF, ceea ce a fost confirmat ulterior de Gardam și colab. 6 TRAF3 și TRAF2 sunt asamblate pentru a forma un complex de reglare cu cIAP1/2 și NIK pentru a inhiba calea de semnalizare NF-κB. 7, 8 Aceste observații definesc rolul central al axei TRAF3-NIK-NF-KB2 în reglarea supraviețuirii celulelor B. Supraviețuirea prelungită a celulelor B este un factor cunoscut predispozant pentru dezvoltarea autoimunității și a limfomului B. 9, 10 Îmbătrânirea șoarecilor B-TRAF3 -/- a dezvoltat niveluri serice ridicate de autoanticorpi către ADN dublu catenar, precum și glomerulonefrită imunocomplexă. Autoimunitatea singură este considerată un factor de risc pentru limfomul B la pacienții cu lupus eritematos sistemic sau sindrom Sjogren. Prin urmare, șoarecii B-TRAF3 -/- pot fi predispuși la tumori maligne ale celulelor B. Aici, raportăm că șoarecii B-TRAF3 -/- au dezvoltat spontan limfoame splenice clonale MZL sau B1a până la vârsta de 18 luni.

Am observat mai întâi că șoarecii B-TRAF3 -/- au redus semnificativ supraviețuirea la vârsta> 9 luni (Figura 1a). Am examinat țesuturile a 50 de șoareci B-TRAF3 -/- cu vârste cuprinse între 9 și 18 luni, 18 care au fost necropsiți când au murit și 32 care nu aveau semne externe de boală în momentul studiului. Toți cei 18 șoareci moribondi B-TRAF3 -/- și 20 din ceilalți 32 (62,5%) aveau limfom B splenic (Tabelul suplimentar 1). Observații aspre și studii microscopice au relevat, de asemenea, implicarea limfomului altor țesuturi, inclusiv măduva osoasă, ganglionii limfatici cervicali și mezenterici, rinichi, plămâni și ficat, precum și ascita (figurile 1b și c și figura suplimentară S1 și materiale și metode suplimentare). Pe baza criteriilor clasificării Bethesd a neoplasmelor limfoide 12, tumorile șoarecilor B-TRAF3 -/- splină au fost MZL, cuprinzând atât MZL de înaltă calitate cu citologie a limfocitelor B mari difuze centroblastice, cât și MZL de grad scăzut cu semne de normalitate Celulele B MZ.

Imagine la dimensiune completă

Mai mult, am folosit citometria în flux pentru a caracteriza caracteristicile imunofenotipice ale celulelor tumorale prezente în splină, măduvă osoasă și ascită (Figura 1d și Figura Adițională S2). Datele de citometrie în flux de la 21 de șoareci individuali sunt rezumate în tabelul suplimentar 2. În conformitate cu diagnosticele histologice, profilurile tumorale imunofenotipice au fost caracteristice limfoamelor cu celule B mature. Cu o singură excepție, toate testele pentru markerii canonici de celule B mature - B220, CD19, IgM, IgD și IgK sau Igλ - au fost pozitive în grade diferite. Un caz excepțional (27-9) a fost IgG + IgM - IgD - cu 20% CD138 +. Profilele imunofenotipice ale celor nouă limfoame examinate seamănă cu profilul celulei B1a, în timp ce celelalte două cazuri seamănă cu profilul celulei B1b. În restul de 10 cazuri, au existat 5 CD5 - CD11b - CD21 + CD23 - care seamănă cu celulele MZ B normale. Mai mult de jumătate (11/21) din limfoamele TRAF3 -/- B provin din celule B1 B și încă 23% (5/21) provin din celule B MZ. Aceasta sugerează că multe cazuri diagnosticate histologic ca limfoame cu celule B mari difuze centroblastice au fost de fapt MZL splenic de înaltă calitate.

Apoi, am efectuat analiza Southern blot a genei IgH a probelor tumorale primare de la 21 de șoareci B-TRAF3 -/- individuali pentru a determina clonalitatea acestora. Rezultatele (Figura 1e) au relevat prezența uneia sau mai multor benzi non-germinale în fiecare dintre ADN-urile testate, indicând expansiuni monoclonale sau oligoclonale ale celulelor B maligne. ADN-ul preparat din două sau trei țesuturi ale aceluiași șoarece a prezentat deseori benzi rearanjate de dimensiuni similare, indicând răspândirea metastatică a aceleiași clone.

Aceste observații ne-au determinat să căutăm dovezi mai directe ale transformării maligne prin transferul intraperitoneal al celulelor tumorale cu populații clonale cunoscute la șoareci NOD SCID imunodeficienți. La 2 până la 3 luni de la transmitere, s-a constatat că șoarecii destinatari aveau limfom infiltrat în mai multe țesuturi. Tumorile transplantate au avut aceleași caracteristici imunofenotipice ca și populația de donatori (Figura 1f). Analiza Southern blot a arătat că una sau două populații clonale din limfoamele primare TRAF3 -/- B au proliferat la șoarecii receptori NOD SCID (Figura 1g). Astfel, limfoamele B spontane care s-au dezvoltat la șoarecii B-TRAF3 -/- sunt clonali, maligne și transplantabile.

Pentru a obține informații suplimentare despre originea, distribuția și istoricul celulelor B maligne, am clonat și secvențiat regiunea IgH V (D) J a limfoamelor de la 11 șoareci B-TRAF3 -/- (Tabelul 1). Secvențe IgH În regiunea a 10 dintre cei 11 șoareci examinați, aceștia nu au prezentat hipermutație somatică semnificativă, sugerând că nu au fost derivate din celule germinale trecute în centru, ci mai degrabă din celule B medii pregerminale naive, celule B MZ sau celule B1 . Interesant, toate secvențele majore de VH identificate în limfoamele TRAF3 -/- B au aparținut uneia dintre cele patru familii de VH, VH1 (J558), VH3 (VH36-60), VH5 (VH7183) și VH12. Aceste familii de gene folosesc adesea celule B MZ, B1 sau autoreactive. Prin urmare, secvențele IgH V (D) J, împreună cu datele histopatologice și imunofenotipice, permit clasificarea limfoamelor B dezvoltate la majoritatea șoarecilor B-TRAF3 -/- ca limfoame splenice MZL sau B1.

Tabel în dimensiune completă

Am demonstrat anterior activarea constitutivă a NF-κB2 și translocația nucleară PKC5 redusă, dar activarea normală NF-κB1 indusă de CD40 în celulele premaligne TRAF3 -/- B. 5 Aici, am extins analizele acestor căi la B-TRAF3 -/- limfoame de șoarece. Am constatat că nivelurile nucleare crescute ale subunităților NF-kB2, p52 și RelB și nivelurile nucleare scăzute ale PKC5 au fost, de asemenea, indicative ale limfoamelor B primare (Figura 2a). În mod interesant, limfoamele TRAF3 -/- B au crescut, de asemenea, ușor nivelurile nucleare de NF-κB1. Astfel, peisajul de semnalizare al limfoamelor TRAF3 -/- B este caracterizat prin activarea constitutivă a căilor NF-kB2 și NF-KB1 (deși într-o măsură mai mică), precum și prin translocația nucleară PKC5 redusă.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a testa dacă căile aberante de activare NF-κB pot servi drept ținte terapeutice pentru neoplasmele de celule B asociate cu inactivarea TRAF3, am evaluat efectele medicamentelor care modulează activarea NF-κB utilizând celulele limfomului B primare purificate B-TRAF3 asupra viabilității celulare . -/- șoareci. Am folosit inhibitorul IKK2, BMS-345541, 13 și inhibitorul NF-κB, oridonina. 14 Efectele acestor substanțe au fost comparate cu cele ale medicamentelor utilizate clinic pentru tratarea limfoamelor B sau a leucemiilor - vincristina, tot acidul trans-retinoic, doxorubicina și ciclofosfamida. Am constatat că oridonina a prezentat o activitate tumorală puternică dependentă de doză pe celulele limfomului primar, în timp ce BMS-345541 și patru medicamente clinice erau inactive (figurile 2b și c și figura suplimentară S3).

Pentru a înțelege mecanismele oridoninei, am determinat nivelurile subunităților NF-κB și NF-κB1 din extractele citosolice și nucleare ale limfoamelor B primare. Nivelurile de NF-κB2 și NF-κB1 activate în nucleu au fost semnificativ reduse în celulele limfomului B tratate cu oridonină (Figura 2d). Mai mult, oridonina nu a afectat translocarea nucleară PKC5 sau activarea ERK, p38, JNK și AKT (Figura 2d și datele nu sunt prezentate). Astfel, efectele tumorale puternice ale oridoninei pot fi atribuite activității sale în inhibarea activării NF-κB2 și NF-κB1, sugerând că oridonina sau o substanță strâns înrudită ar trebui considerate noi candidați pentru tratamentul neoplasmelor cu celule B caracterizate. . inactivarea genetică/epigenetică a TRAF3.

Am încercat în continuare să reducem în mod specific nivelul NF-κB2 folosind vectori shRNA lentivirali pentru a evalua rolul activării constitutive a NF-κB în limfomageneza TRAF3 -/- B. Am testat 4 vectori shRNA lentivirali NF-κB2 shRNA. NF-κB shRNA 653 și 1226 au suprimat proteinele NF-κB2 p100 și p52 cu -95% și, respectiv, 75%. Ulterior am folosit aceste lentivirusuri shRNA pentru a transduce linia celulară 27-9.5.3 TRAF3 -/- limfom B generată în acest studiu (materiale și metode suplimentare). Interesant este faptul că NF-κB2 shRNA 653 și 1226 au inhibat proliferarea și au indus apoptoza în celulele 27-9.5.3. Foarte important, eficacitatea celor doi shRNA în coagularea proteinelor NF-κB2 s-a corelat cu capacitatea lor de a inhiba proliferarea și de a induce apoptoza în celulele limfomului TRAF3 -/- (Figura 3). Deși este necesară confirmarea prin alte linii de limfom TRAF3 -/- B, datele noastre sugerează că activarea constitutivă a NF-κB2 este una dintre căile oncogene majore în celulele TRAF3 -/- B.

ShARN-urile NF-κB au indus apoptoza în celulele limfomului TRAF3 -/-. Celule limfom B de șoarece (linia celulară M12.4.1 în ( A ) și linia celulară TRAF3 -/- limfom B 27-9, 5, 3 in ( b, c, d )) au fost transduse cu lentivirusuri care exprimă shRNA NF-κB murin sau shRNA amestecat (SCR). A ) Nivelurile totale de proteine ​​celulare p100 și p52 NF-κB2 determinate prin analiza imunoblotului. Proteinele au fost preparate din celulele limfomului B transduse cu shRNA amestecat sau NF-KBB shRNA 653, 1226, 2716 sau 2996. Un imunoblot de actină a fost utilizat ca control de încărcare. ( b ) Curbele de creștere a celulelor vii și ( c ) procentul de celule vii versus celule moarte determinat prin numărarea celulelor colorate în albastru de tripan. Graficele arată rezultatele a trei experimente independente (medie ± sd). d ) Profiluri FACS reprezentative ale celulelor transduse analizate prin anexină V și colorare cu iodură de propidiu (PI). Celulele apoptotice au fost identificate ca anexina V + PI-, celulele moarte au fost anexina V + PI +, iar celulele vii au fost anexina V-PI-. Datele reprezintă trei experimente independente.

Imagine la dimensiune completă

Studiile care au identificat deleții și mutații TRAF3 în leucemia limfocitară cronică cu celule B, MZL, limfom cu celule de manta, macroglobulinemia Waldenström și mielomul multiplu sugerează funcția potențială de supresie tumorală a TRAF3. 1, 2, 3, 4 Paradoxal, șoarecii transgenici care supraexprimă TRAF3 în celulele B prezintă boli autoimune, inflamații sistemice și sunt predispuși la cancer. 15 O opțiune prezentată de Zapata și colab. 15 este că TRAF3 poate promova diferențierea celulelor plasmatice. Alternativ, fenotipul neașteptat al șoarecilor transgenici TRAF3 se poate lega potențial de un situs de inserție transgenică în genom care poate afecta expresia sau funcția altor gene (e) importante, având în vedere că a fost examinată în detaliu doar o singură linie fondatoare transgenică. 15 Aici, dezvoltarea spontană, extrem de penetrantă a limfoamelor B la șoarecii B-TRAF3 -/- oferă dovezi convingătoare că Traf3 este o genă supresoare tumorale în celulele B.

Datele combinate prezentate în acest studiu sugerează că șoarecii B-TRAF3 -/- modelează îndeaproape splina umană MZL și leucemia limfocitară cronică cu celule B. Folosind celulele limfomului B derivate de la șoareci B-TRAF3 -/- ca sisteme model, am arătat că oridonina și NF-KBB2 shRNA au potențial terapeutic. Descoperirile noastre sugerează că recuperarea proteinei TRAF3 sau a căilor sale de semnalizare în aval este o cale terapeutică importantă pentru limfoamele B. În această privință, șoarecii B-TRAF3 -/- oferă un instrument util pentru dezvoltarea și testarea medicamentelor terapeutice pentru tratamentul neoplasmelor de celule B umane care implică inactivarea TRAF3 sau modificări genetice/epigenetice conexe.