genomului

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Analiza asocierii genomului primului răspuns
  • Analiza asocierii care durează o reacție în întregul genom
  • Analiza asocierii genomului a frecvenței convulsiilor meciurilor
  • Analiza asocierii genomului latenței generale, duratei, frecvenței și tipului de coping
  • Replicarea în cea de-a doua turmă de hibrizi
  • identificare eQTL
  • discuţie
  • metode
  • Declarație etică
  • Animale, prelevarea de probe și măsurarea proprietăților
  • Măsurarea cortizolului
  • Genotiparea SNP
  • Combinație de management comportamental la nivelul întregului genom
  • Replicarea într-o a doua turmă de purcei încrucișați
  • PCR cantitativă
  • detectarea eQTL
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere Excel
  • Tabel suplimentar 1
  • Tabelul suplimentar 2
  • Tabelul suplimentar 3
  • Tabelul suplimentar 4
  • Tabelul suplimentar 5
  • Tabelul suplimentar 6
  • Comentarii

obiecte

  • Profilarea expresiei genice
  • Rețele de reglementare

abstract

Mai multe regiuni genomice și variante genetice asociate cu răspunsul la stres, agresivitate și depresie au fost raportate la oameni, precum și la modelele animale 24, 25, 26. Porcii împărtășesc numeroase similitudini fiziologice și genomice cu oamenii și, prin urmare, oferă un model trasabil pentru studierea determinării genetice a trăsăturilor comportamentale, fiziologice și metabolice 27. De fapt, proprietățile cantitative comportamentale ale loci (QTL) au fost mapate pe stres 10, comportament dietetic 28, comportament matern 29 și indicatori comportamentali sănătoși și de boală 30 în modelele de porci.

Rezultatul

Un total de 294 de purcei germani Landrace au fost genotipați folosind un BeadChip de la Illumina PorcineSNP60, care consta din 62.163 loci. După filtrare, 48.909 SNP-uri au fost utilizate pentru analize suplimentare. Cei mai recenți parametri (latența, durata, frecvența luptelor în patru puncte de timp) și tipul de gestionare a sarcinii (reactiv ridicat (HR), indistinctiv (IR), redus reactiv (LR)) au fost utilizați pentru studiul de asociere (Tabelul 1) . 465 SNP au fost semnificativ asociate cu cel puțin una dintre cele mai posterioare caracteristici. Am măsurat nivelurile de cortizol și coeficienții de corelație ai comportamentului de management, iar nivelurile de cortizol au variat de la | 0, 11-0, 20 | și a indicat o corelație semnificativă (p

Liniile negre la log10 negativ (NegLog10) 5 corespund FDR

Liniile negre la log10 negativ (NegLog10) 5 corespund FDR 10-6. Acest SNP a fost, de asemenea, asociat semnificativ cu frecvența convulsiilor de lupte în zilele 12 și 19. În ziua 12, frecvența combaterii convulsiilor a fost semnificativ asociată cu SNP între 52 și 56 Mb pe SSC12. ALGA0056876 pe SSC10 a fost cel mai puternic asociat (p 10-6) cu Fd12. Etichetele asociate cu Fd19 au fost plasate pe SSC12 (53 - 56 Mb), SSC6 (25 Mb) și SSC17 (50 - 56 Mb). SNP-urile (ASGA0055092, ALGA0066975, ALGA0121951) situate pe SSC12 se aflau în PER1. De asemenea, am constatat că Fd26 a fost semnificativ asociat cu SNP-uri pe SSC17 (37 și 64 Mb), SSC1 (22 Mb) și SSC12 (53-56 Mb).

Liniile negre la log10 negativ (NegLog10) 5 corespund FDR 10-5 și FDR

Liniile negre la log10 negativ (NegLog10) 5 corespund FDR

Culoarea indică nivelul dezechilibrului conexiunii dintre loci, așa cum se arată în tastă. Blocul LD 4 a fost cel mai mare bloc situat între 55 și 56 Mb.

Imagine la dimensiune completă

Zece SNP-uri au fost asociate cu tipul de management în FDR 10-7). Celelalte cinci transcrieri (RANGRF, PER1, PDZRN3, SH2D4B și LONP2) conțineau eQTL trans (media p = 1,2 x 10-6). Reprezentarea eQTL-urilor cis și trans este prezentată în Figura 6. În general, 38 din cele 465 SNP-uri care au fost semnificativ asociate cu cele mai vechi 13 trăsături au fost, de asemenea, semnificativ asociate cu nivelurile de transcriere CTC1, UBOX5, RAD51B, IL19, CPAMD, ASGR1 și FBXO39. . Interesant este că toate erau cIS eQTL-uri.

Cei șase markeri asociați cu toate cele 13 caractere de testare înapoi au fost ASGA0055092, ASGA0105202, H3GA0034753, ALGA0066975, ALGA0121951 și MARC0073387, situate pe SSC12 (55-56 Mb) în CTC1, PER1 și LOC100739126 (nud de proteine ​​de distribuție nucleară), adică g ) cu cis eQTL, trans-eQTL sau funcții probabile.

De fapt, acești SNP au fost, de asemenea, asociați cu niveluri transcripționale de CTC1 în hipotalamus ca cis eQTL. CTC1 (CTS telomere maintenance component component 1) codifică o componentă a complexului CST care protejează telomerii de degradare. Polimorfismele CTC1 provoacă microangiopatie cerebrală 39. Posibilul rol al CTC1 pentru comportament rămâne neclar, deși există indicii ale unui impact asupra neuronilor centrali și periferici. Am constatat că alela A a ASGA0105202 în CTC1 este semnificativ mai mare în LR decât în ​​HR; alela este asociată cu o expresie mai mare a CTC1 și CTC1 este mai mare în LR decât în ​​HR. Această relație triunghiulară consistentă a polimorfismului genetic, variația fenotipului și expresia genei demonstrează CTC1 ca o genă care contribuie la o schimbare genetică în comportamentul de coping.

De fapt, EQTL completează GWAS cu cele mai importante caracteristici nu numai indicând regiuni genomice identice, ci și gene specifice din aceste regiuni cu LD ridicat. ExpressionQTL-urile, în special cis eQTL-urile, oferă dovezi suplimentare pentru asocierea genelor, deoarece aceste gene conțin SNP-uri care sunt asociate cu cele mai posterioare trăsături și, de asemenea, cu propriul nivel de expresie, care la rândul său este asociat cu cele mai posterioare trăsături. SNP-urile asociate cu trăsătura sunt mai susceptibile de a fi eQTL-uri, în concordanță cu rolul SNP-urilor de reglementare în variația fenotipică. Ca urmare, aplicarea informațiilor eQTL poate îmbunătăți descoperirea SNP-urilor asociate cu particularitatea fenotipurilor complexe 38, 40 .

Genele asociate cu trăsăturile de testare din spate sunt asociate cu neurogeneza și activitatea neuronală. De exemplu, o genă similară cu factorul nuclear de distribuție E reglează neurogeneza dezvoltării și poziționarea neuronilor corticali 45, 46. Analizele genetice au relevat o legătură între factorul de distribuție nucleară E (NDE1 sau NudE) și ortologul său NDE-like 1 (NDEL1 sau Nudel) cu tulburări mentale 47, 48 .

WRAP53 este situat pe SSC12 (55-56 Mb), care este regiunea asociată cu cele mai posterioare proprietăți și joacă un rol important în funcțiile telomerice care afectează ciclul celular 49, 50. WRAP53 (care conține repetări WD, antisens la TP53) are implicații pentru supraviețuirea neuronilor motori 51. Codifică o componentă esențială a complexului holoenzimatic telomerazic, este implicat în construcția și întreținerea corpurilor Cajal, suborganisme care mediază modificările ARN.

Canalele activate de hiperpolarizare și canalele ciclice direcționate către nucleotide (HCN) sunt codificate de patru gene (HCN1-4) și sunt exprimate pe scară largă în inimă și sistemul nervos central. HCN1 este izoforma predominantă despre care se știe că este exprimată în hipocamp, neocortex și cortex 52. Canalele HCN sunt implicate în excitația și activitatea sinaptică a neuronilor în neuroni individuali și rețele neuronale 53. Se raportează că canalele HCN1 limitează învățarea și memoria și sunt implicate în multe boli, cum ar fi epilepsia, boala Alzheimer și nevralgia periferică 54, 55, 56. În mod similar, proteinele Liprin-α sunt componentele proteice majore ale sinapselor și contribuie la transmiterea sinaptică în diferite regiuni ale creierului 57, 58. Sa raportat că liprin-a duce la un defect al dezvoltării și funcției presinaptice 59. Ambele SNN atât în ​​HCN, cât și în Liprin au fost asociate cu stilul de management în acest studiu, dar nu și cu nivelurile lor de transcripție.

Alte gene care poartă eQTL-uri cis, cum ar fi UBOX5 și FBXO39, codifică proteinele cutiei U și ale cutiei F și acționează ca proteine ​​ubiquitin ligase 60, 61. Membrii familiei RAD51 funcționează atât în ​​recombinarea omologă mitotică cât și în cea meiotică și în repararea ADN-ului. S-a demonstrat că RAD51B este asociat cu cancerul de sân și sindromul Werner, care se caracterizează prin neurodegenerare progresivă 62, 63. SNP-urile găsite în aceste 3 gene sunt asociate cu gestionarea comportamentală și, de asemenea, cu nivelul transcrierilor lor ca cis eQTL.

Un alt domeniu de interes a fost SSC3 (139, 8–139, 9 Mb), cu 3 SNP-uri (ALGA0107834/ASGR1, ALGA0066945 și ALGA0066946) asociate cu primele 8-13 caractere. Nivelurile de transcriere ASGR1 au fost, de asemenea, asociate cu ALGA0066945 și ALGA0066946. ASGR1 codifică o subunitate a receptorului asialoglicoproteinei și mediază absorbția și endocitoza galactozei (Gal) și a N-acetilgalactozaminei (GalNAc) glicoproteine ​​terminale. ASGR1 este puternic exprimat în hepatocite 64 și mult mai slab în alte țesuturi, inclusiv glanda tiroidă 65 și monocitele din sângele periferic 66. Receptorii asialoglicoproteici sunt implicați în transportul tiroglobulinei și oferă legături cu hormoni tiroidieni cu consecințe comportamentale 67. Am constatat că ASGR1 este exprimat în hipotalamus și a demonstrat că nivelurile sale de transcriere sunt asociate cu markeri SNP, care sunt asociați și cu stilul de gestionare a porcilor.

Recent s-a sugerat că dezechilibrele sistemului imunitar joacă un rol important în stresul mental și comportamentul 37, 68. SNP-urile găsite în genele CPAMD8 și IL9 care sunt legate de funcția imună au fost asociate cu managementul și nivelul de transcripție (cis eQTL) în acest studiu. CPAMD8 este un membru al familiei complementului 3/alfa (2) -macroglobulină (C3/alfa (2) M) și are funcții imune înnăscute 69. S-a demonstrat că stresul psihologic crește producția de citokine imunosupresoare, inclusiv IL19, prin activarea beta-adrenoreceptorilor, care pot afecta procesele bolilor legate de stres 68. Recent, s-a dovedit că haplotipul presupus cu acțiune cis al genei IL19 este asociat cu schizofrenia 70. SNP-urile găsite în genele CPAMD8 și IL9 s-au dovedit a fi asociate cu un stil de management, sugerând o relație între sistemul imunitar și comportament.

Rezultatele noastre reprezintă prima analiză de asociere bazată pe genomul SNP pentru trăsăturile comportamentale legate de tipul de coping. Genele hipotalamice au fost identificate în regiunile QTL care arată un dezechilibru semnificativ în legarea eQTL. Cele mai asociate regiuni au fost SSC12 (53-56 Mb) care transportă semnale cis eQTL (CTC1 și FBXO39) și semnale trans eQTL (PER1 și RANGRF). Alte semnale cis eQTL au inclus ASGR1 situat pe SSC3, IL19 și CPAMD8 situat pe SSC2 și UBOX5 și LOC10051179 situat pe SSC17. SNP-urile localizate pe HCN1 (SSC16) și Liprin-α (SSC2), care au fost asociate cu tulburări neuropatologice, nu au prezentat semnale cis sau trans eQTL. Se știe că genele identificate în acest studiu sunt implicate în semnalizarea funcției telomere, funcția imunitară, sistemul ubiquitinei, precum și calea ritmului circadian și receptorii neurotransmițătorilor, adică problemele neuronale comportamentale care oferă perspective pentru derivarea markerilor pentru predicția reproducerii. În special în CTC1 și PER1 cu implicații fiziologice cunoscute în sistemul nervos central, rolul lor în comportament a fost demonstrat de cis-eQTL și asocierea confirmată într-o populație independentă.

metode

Declarație etică

Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu reglementările și liniile directoare relevante. Animalele au fost furnizate la Institutul Leibniz pentru Biologia Animalelor de Fermă (FBN). Procedurile de îngrijire a animalelor și de colectare a țesuturilor au fost reglementate de Legea germană privind bunăstarea animalelor, iar protocolul experimental a fost aprobat de Comitetul pentru bunăstarea animalelor al Institutului de biologie a animalelor din Leibniz și Mecklenburg-Pomerania Occidentală (MVensamitt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit L FALL; TSD/7221, 3-2, 1-020/09). Protocolul experimental a fost realizat în conformitate cu liniile directoare aprobate pentru asigurarea unei bune practici științifice în instituțiile de la Leibniz.

Animale, prelevarea de probe și măsurarea proprietăților

Porcii germani Landrace (DL) (R = 294) au fost supuși unui back-test așa cum s-a descris anterior 33. Pe scurt, am efectuat în mod repetat un studiu retrospectiv de 1 minut al purceilor domestici la vârsta de 5, 12, 19 și 26 de zile. Animalele au fost așezate pe spate într-un dispozitiv special în formă de V. Testul a durat exact 60 de secunde și a început imediat după ce purcelul stătea întins pe spate. Au fost înregistrate latența (L, timpul până la primul meci), durata (D, timpul de meci cumulat într-o perioadă de test de 1 minut) și frecvența (F) a atacurilor de lupte. Rezultatele de la fiecare parametru la fiecare vârstă testată au fost calculate pentru a reflecta suma latenței totale (tL), a duratei totale (tD) și a frecvenței totale (tF) pentru fiecare purcei individual. Purceii au fost clasificați ca reactivitate ridicată (HR), neclară (IR) sau scăzută (LR) conform următoarelor criterii: latența HR a fost ≤ 5 s și LR ≥ 35 s, durata HR a fost ≥ 25 s, LR ≤ 5 s, iar frecvența HR a fost ≥4 și LR ≤ 71 .

Măsurarea cortizolului

Secreția totală de cortizol a fost măsurată dimineața prin prelevarea a 50 ml de sânge stem de la fiecare porc în timpul sângerării la aproximativ 180 de zile. Sângele a fost colectat într-un tub de plastic conținând 1 ml EDTA 0,5 M, depozitat pe gheață până la izolarea plasmei și apoi depozitat la -80 ° C pentru perioade lungi de timp. Nivelurile totale de cortizol plasmatic au fost determinate prin testul imunosorbent legat de enzime (DRG, Marburg, Germania) în duplicat conform protocolului producătorului. Variantele de variație între teste au fost ≤ 7,0%, respectiv 9,8%. De asemenea, s-au calculat coeficientul de corelație Spearman (Spearman rho, rs) și relația dintre nivelurile de cortizol și managementul comportamentului.

Genotiparea SNP

Genotiparea a fost efectuată folosind un PorcineSNP60 BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, SUA) conform protocolului SNP Infinium HD al producătorului. Pe scurt, 200 ng de ADN au fost amplificate, fragmentate și hibridizate la un PorcineSNP60 BeadChip conținând 62, 163 de 50-meri locus-specifici. Datele de intensitate au fost măsurate și scorurile de calitate și genotipurile au fost derivate folosind software-ul GenomeStudio (Illumina Inc.). Miery hovorov (72, 73. În plus, genotipul și sexul au fost utilizate ca efecte fixe, ziua nașterii a fost utilizată ca efect aleatoriu, iar greutatea purcelușilor a fost utilizată ca covariabil. A fost efectuat și un test de genotip pentru asocierea alelelor SNP. corect pentru testări multiple, a fost utilizată o rată de descoperire falsă (FDR) de 5%.

Replicarea într-o a doua turmă de purcei încrucișați

În total au fost utilizate 794 de animale încrucișate din rasele germane Landrace (DL) și Large White (DE). Datele au fost colectate de la ferma de cercetare a Institutului de creștere și creștere a animalelor din Universitatea Kiel. Testele de 1 min au fost efectuate în mod repetat la vârsta de 12 și 19 zile. SNP-urile cele mai semnificative din PER1 (ASGA0055092) și CTC1 (ASGA0105202) au fost utilizate pentru genotipare prin pirosecvențiere. Pentru analiza asocierii s-au utilizat modele mixte liniare generalizate (Proc Glimmix; JMP Genomics (SAS Institute, Cary, NC, SUA)) cu matricile de tipuri ale indivizilor considerați ca efect aleatoriu, genotip și gen ca efecte fixe. Pentru a corecta testarea multiplă, a fost utilizată o rată de descoperire falsă (FDR).

PCR cantitativă

detectarea eQTL

Nivelurile de expresie a 37 de transcrieri din hipotalamusul a 184 de indivizi reprezentând un subset al celor utilizate pentru testele din spate au fost supuse unei analize de varianță a modelului mixt folosind JMP Genomics (Proc Mixed; SAS Institute, Rockville, MD). Ca și în GWAS a trăsăturilor de testare din spate, o matrice IBD între indivizi a fost utilizată ca efect aleatoriu și componentele principale de top ca covariabile corectate pentru stratificarea populației. În plus, genotipul, genul și lotul de RT-PCR au fost utilizate ca efecte fixe, iar greutatea la sacrificare și media valorilor CT ale genei de menaj au fost utilizate ca covariabile. Pentru a corecta testarea multiplă, a fost utilizată o rată de descoperire falsă (FDR) de 5%. Am definit un eQTL ca „cis” dacă un SNP asociat a fost localizat într-o zonă mai mică de 1 Mb de genă. Toate celelalte eQTL au fost considerate „trans”.

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Ponsuksili, S. și colab. Studiile integrate de asociere la nivel de genom și hipotalamusul eQTL indică o legătură între gena PER1 legată de ritmul circadian și comportamentul de coping. Știință. reprezentant. 5, 16264; doi: 10.1038/srep16264 (2015).