obiecte

abstract

Microglia reprezintă obiective raționale, dar provocatoare, pentru îmbunătățirea integrității substanței albe datorită sarcinilor lor dualiste de protecție și toxice. Prezentul studiu investighează efectul acizilor grași polinesaturați Omega-3 (n-3 PUFA) asupra răspunsurilor microgliale la patologia mielinei în culturile primare și într-un model de scleroză multiplă (SM), o boală demielinizantă devastatoare. Acidul docosahexaenoic (DHA) și acidul eicosapentaenoic (EPA), cele două forme majore de n-3 PUFA în creier, au inhibat eliberarea oxidului azotic și a factorului de necroză tumorală-α din microglia primară după stimularea cu IFN-γ și mielină. DHA și EPA au crescut și fagocitoza mielinei in vitro. Prin urmare, n-3 PUFA pot inhiba inflamația în timp ce promovează răspunsuri imune benefice, cum ar fi fagocitoza microglială. Studiile in vivo au arătat că suplimentarea cu PUFA n-3 reduce demielinizarea indusă de pete și îmbunătățește funcția motorie și cognitivă. Efectele pozitive ale n-3 PUFA au fost însoțite de o schimbare a polarizării microgliale către un fenotip M2 benefic in vitro și in vivo. Aceste rezultate sugerează că n-3 PUFA-urile pot fi utile din punct de vedere clinic ca agenți imunomodulatori pentru bolile demielinizante printr-un mecanism nou care implică comutarea fenotipului microglial.

În funcție de mediu, microglia diferă prin fenotip. În timp ce fenotipul M1 „activat clasic” este asociat cu o prezentare crescută a antigenului și producerea de citokine toxice și specii reactive de oxigen, fenotipul M2 „activat alternativ” abordează eliminarea resturilor celulare, rezoluția inflamării locale și eliberarea. factori trofici care favorizează regenerarea după leziuni neurologice 5, 6. Se știe că polarizarea fenotipului este afectată de progresia multor boli neurologice, inclusiv MS 7, accident vascular cerebral 8, leziuni traumatice ale creierului 9 și leziuni ale măduvei spinării 10, 11 și, prin urmare, poate reprezenta o potențială țintă terapeutică pentru tulburările neurologice.

Acizii grași polinesaturați omega-3 (n-3 PUFA) au fost studiați pentru efectele lor benefice în multe modele animale de boli neurodegenerative, cum ar fi boala Alzheimer 12, 13, 14 și boala Parkinson 15. Se știe că mai multe mecanisme stau la baza neuroprotecției mediată de PUFA n-3, cum ar fi suprimarea morții celulare, inhibarea inflamației și promovarea neurogenezei. Studii recente au investigat, de asemenea, efectul PUFA n-3 asupra patologiei substanței albe. De exemplu, suplimentarea cu PUFA n-3 este asociată cu mai puține leziuni de substanță albă și cu funcții de performanță îmbunătățite la adulții vârstnici 16, 17. În plus, mai multe studii epidemiologice sugerează că suplimentarea n-3 cu PUFA este asociată cu rezultate clinice îmbunătățite la pacienții cu SM 18, 19. Efectele benefice ale suplimentării cu PUFA n-3 au fost, de asemenea, descrise într-un model experimental de SM cu encefalomielită autoimună experimentală (EAE) și sunt atribuite efectului modulator al acidului docosahexaenoic (DHA) asupra activării celulelor T dependente de celula dendritică 20. Cu toate acestea, efectul PUFA n-3 asupra microgliei de răspuns în SM sau în alte patologii ale substanței albe nu a fost investigat.

În studiul de față, am folosit culturi microgliale primare și un model animal de demielinizare indus de efectul neglijabil al n-3 PUFA asupra răspunsurilor microgliale la patologia mielinei. Am constatat că DHA și acidul eicosapentaenoic (EPA), PUFA n-3 major din sistemul nervos central, au inhibat în mod dependent de concentrație eliberarea microglială a mediatorilor inflamatori ca răspuns la stimularea mielinei și a IFN-γ și a crescut fagocitoza mielinei în vitro. Studiile ulterioare ale mecanismului au arătat că DHA și EPA pot deplasa polarizarea microgliană către fenotipul M2 în condiții fiziologice in vitro și pot inhiba polarizarea M1 în condiții inflamatorii. Studiile in vivo confirmă în plus că suplimentarea cu n-3 PUFA reduce demielinizarea indusă de un efect neglijabil și îmbunătățește abilitățile motorii și cognitive. Aceste efecte benefice ale n-3 PUFA într-un model animal au fost, de asemenea, însoțite de o trecere la fenotipul microglial M2 in vivo .

Rezultatul

DHA și EPA inhibă răspunsurile inflamatorii în microglie

Pentru a determina dacă DHA și EPA pot modula activarea microglială, microglia primară a fost tratată cu DHA sau EPA timp de 24 de ore, urmată de stimulare LPS (2,5 ng/ml) pentru alte 24 de ore. Eliberarea de oxid nitric (NO) și TNFα în mediul de cultură este măsurată ca markeri ai răspunsului inflamator. Așa cum se arată în Figura 1, pretratarea DHA a atenuat semnificativ eliberarea de NO și TNFα indusă de LPS într-o manieră dependentă de concentrație, începând de la 20 μM (Figura 1A și 1D). Efectul EPA a fost similar calitativ cu cel al DHA (Figura 1B și 1E). Cele mai mici concentrații de DHA (20 μM) și EPA (20 μM) care au inhibat cu succes atât eliberarea de NO, cât și TNFα au fost apoi utilizate în majoritatea experimentelor ulterioare. Suprimarea producției de NO și TNFα nu a putut fi explicată prin toxicitatea celulară asociată cu DHA și EPA, deoarece nici DHA și EPA nu au crescut eliberarea extracelulară de LDH în mediu (Figura 1C și 1F).

suplimentarea

(A-F) Microglia primară inoculată la 5 x 104/godeu a fost pretratată cu diferite concentrații de DHA sau EPA (5-80 μM) timp de 24 de ore, urmată de stimulare LPS (2,5 ng/ml). Mediul de cultură a fost colectat la 24 de ore după LPS. Producția de oxid nitric (NO) (A, D) și factor de necroză tumorală-α (TNF-α) (B, E) a fost măsurată ca markeri ai inflamației. Producția de lactat dehidrogenază (LDH) (C, F) a fost măsurată ca test al morții celulare. (G - J) Microglia primară inoculată la 5 x 104/godeu a fost pretratată cu DHA (20 μM) sau EPA (20 μM) timp de 24 de ore, urmată de mielină (1, 5 sau 10 μg/ml) cu sau fără IFN- stimulare γ (5 ng/ml) pentru încă 24 de ore. NO extracelular (G, I) și TNF-a (H, J) au fost măsurate în mediu de cultură. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM a trei până la patru experimente independente, fiecare realizat în triplicat. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 în comparație cu tratamentul vehiculului.

Imagine la dimensiune completă

Am confirmat în continuare efectul inhibitor al DHA și EPA asupra răspunsurilor microgliene inflamatorii într-un model in vitro legat de boală, folosind mielină și IFNγ ca stimulatori inflamatori. În timp ce factorii individuali de activare au generat doar un răspuns microglial slab, mielina și co-tratamentul cu IFNγ au arătat efecte sinergice puternice și dependente de concentrație asupra markerilor inflamatori din microglie (Figura 1G-J). În plus, pretratarea cu DHA (20 μM) sau EPA (20 μM) a redus semnificativ producția de NO (indusă de mielină + IFNγ) (Figura 1G și 1I) și TNFα (Figura 1H și 1J). Aceste date sugerează cu tărie că n-3 PUFA inhibă răspunsurile microgliene la stimulii inflamatorii asociați cu MS. În plus, EPA pare să aibă efecte antiinflamatorii puțin mai mari.

DHA și EPA cresc fagocitoza mielinei în microglia

Pentru a examina efectul PUFA n-3 asupra fagocitozei mielinei, microglia a fost incubată cu diferite concentrații de DHA sau EPA variind de la 5 μM la 80 μM timp de 24 de ore. Mielina marcată cu Cyel a fost adăugată la culturi timp de încă 6 ore. După spălare, fagocitoza mielinei a fost cuantificată prin măsurarea fluorescenței Cy3 în lizatul celular. Tratamentul cu DHA (Figura 2A) sau EPA (Figura 2B) la concentrații de 10-40 μM a crescut semnificativ fagocitoza mielinei. Imagistica confocală a confirmat că tratamentul DHA (20 μM) - sau EPA (20 μM) a crescut fagocitoza microglială (Figurile 2C).

Microglia primară a fost pretratată cu diferite concentrații de DHA sau EPA (5-80 μM) timp de 24 de ore, urmată de incubație cu mielină marcată cu Cy3 (0,5 μg/ml) timp de încă 6 ore. (A, B) Fagocitoza mielinei a fost cuantificată ca fluorescență intracelulară. (C) Imagini reprezentative care arată că tratamentul cu DHA (20 μM) sau EPA (20 μM) a crescut fagocitoza mielinei. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM a trei până la patru experimente independente, fiecare realizat în triplicat. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 în comparație cu tratamentul vehiculului.

Imagine la dimensiune completă

DHA și EPA modulează polarizarea microglială în condiții fiziologice și inflamatorii

După cum sa menționat în introducere, se știe că microglia ocupă fenotipuri diferite, cum ar fi M1 și M2, ca răspuns la diferiți stimuli externi 10, 21. Prin urmare, am folosit un câmp PCR cu randament ridicat pentru a analiza expresia mai multor gene de semnalizare M1 și M2 în microglia tratată cu DHA sau EPA. Atât DHA, cât și EPA au arătat tendințe remarcabile de creștere a reglării genelor M2 și de scădere a genelor M1 în condiții fiziologice (Figura 3A - 3B).

Microglia primară inoculată la 5 x 104/godeu într-o placă cu 6 godeuri a fost pretratată cu DHA sau EPA (câte 20 μM fiecare) timp de 24 de ore. PCR-urile în timp real (A-B) arată că tratamentul cu DHA (A) și EPA (B) a inhibat semnificativ expresia mai multor gene M1 și a îmbunătățit expresia genelor M2. PCR în timp real (C-F) a arătat o stimulare semnificativă a genei CD206 (C) și TGFβ (D) legate de M2 ​​după tratamentul cu DHA sau EPA. În plus, pretratarea cu DHA sau EPA a inhibat în mod semnificativ expresia genelor legate de M1 TNF-α (E) și iNOS (F) după stimularea LPS (2,5 ng/ml) timp de 24 de ore. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 versus control; P = 0,01, ## P = 0,001 față de LPS.

Imagine la dimensiune completă

De asemenea, am folosit PCR convențional în timp real pentru a verifica efectele DHA și EPA asupra polarizării microgliale. Microglia primară a fost tratată cu DHA (20 μM) sau EPA (20 μM) timp de 24 de ore. În concordanță cu datele de câmp PCR, tratamentul cu DHA și EPA a crescut semnificativ expresia CD206 și/sau TGFβ, două gene reprezentative M2, în condiții fiziologice (Figura 3C-3D). Tratamentul cu DHA sau EPA nu a inhibat expresia TNFα și iNOS, două gene reprezentative M1, în condiții fiziologice, dar a redus semnificativ producția acestor două gene inflamatorii după stimularea LPS timp de 24 de ore (Figura 3E și 3F). Aceste date sugerează că DHA și EPA pot modula polarizarea fenotipică a microgliei atât în ​​condiții fiziologice cât și patologice.

Suplimentarea n-3 PUFA reduce demielinizarea la un model de șoarece cu SM

Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă conținând 0,2% cuprizonă cu (N3H) cu sau fără (N3L) n-3 PUFA îmbogățire timp de 5 săptămâni. (A) Leziunile demielinizante din corpul calos (CC) au fost relevate prin colorarea Luxol fast blue (LFB) (stânga), colorarea MBP și microscopia electronică (EM, dreapta). Modificările patologice ale axonilor au fost relevate prin imunomarcare cu SMI32. Imaginile sunt reprezentative pentru secțiuni de la patru animale. (B) Intensitatea MBP a fost măsurată și calculată ca schimbare a pliului în comparație cu valoarea simulată. (C) Raportul dintre SMI32 și MBP a fost calculat ca un indicator al deteriorării substanței albe (daune axonale și demielinizare). (D) Analiza Western blot a expresiei MBP. n = 4 șoareci pentru fiecare grup. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 comparativ cu controalele simulate.

Imagine la dimensiune completă

Suplimentarea n-3 PUFA reduce deficitele neurologice de comportament într-un model de demielinizare tratat cu cuprizonă

Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă conținând 0,2% cuprizonă cu (N3H) cu sau fără (N3L) n-3 PUFA îmbogățire timp de 5 săptămâni. (A - C) Testul labirintului cu apă Morris a fost efectuat la 28-32 de zile după începerea dietei cuprizone. (A) Imagini reprezentative ale căilor plutitoare ale șoarecilor din fiecare grup când platforma era prezentă (navigare la fața locului; faza de învățare) și după îndepărtarea acesteia (testul sondei; faza de memorie). (B) Latența de a scufunda localizarea platformei a fost măsurată la șoareci cu dietă regulată suplimentată cu n-3 PUFA și la 28 până la 31 de zile după începerea dietei cuprizone. (C) Memoria spațială a locației platformei scufundate anterior a fost măsurată la șoareci cu dietă regulată suplimentată cu n-3 PUFA și 32 de zile după începerea dietei cuprizone. Memoria spațială este exprimată ca timpul petrecut în cadranul țintă când platforma a fost îndepărtată. (D) Test Rotarod înainte și după 2-5 săptămâni de tratament cu calrizonă. n = 8 animale/grup. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 pentru comparațiile date.

Imagine la dimensiune completă

Suplimentarea n-3 PUFA promovează polarizarea microgliei M2 într-un model animal de demielinizare tratată cu cuprizonă

Pentru a investiga efectele PUFA n-3 asupra polarizării microgliene într-un model in vivo de boală demielinizantă, am măsurat expresia unei serii de gene de semnalizare M1 și M2 prin RT-PCR. După cum era de așteptat, expresia genelor M1 (CD16 și iNOS) a crescut semnificativ după 5 săptămâni de dietă cuprizonă. Suplimentarea n-3 PUFA a inhibat creșterea acestor gene M1 (Figura 6B) și a crescut expresia celor trei gene M2 (CD206, YM1/2 și Arg1, Figura 6A) la șoarecii tratați cu cuprizonă. Colorarea prin imunofluorescență a arătat în continuare că expresia proteinelor marker M1 (CD16) și M2 (CD206) a fost crescută după 5 săptămâni de dietă cuprizonă (Figura 6C-F). Suplimentarea n-3 PUFA a mutat polarizarea microglială către M2 în acest model, după cum se arată prin expresia crescută a CD206 și inhibarea expresiei CD16 în corpul calos.

Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă conținând 0,2% cuprizonă cu (N3H) cu sau fără (N3L) n-3 PUFA îmbogățire timp de 5 săptămâni. (A-B) PCR în timp real pentru markerii M1 (A) și markerii M2 (B) a fost efectuată folosind ARN total extras din corpul calos. (C) Colorarea reprezentativă a imunofluorescenței a Iba1 cu CD16/32 (M1) sau CD206 (M2) în corpul calos. Scara: 40 μm. (D - F) Cuantificarea celulelor Iba1 + (D), CD16/32 + (E) și CD206 + (F) din corpul calos. n = 4 animale per grup. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01, *** P ≤ 0, 001 față de simulare; #P ≤ 0, 05, ## P ≤ 0, 01, ### P ≤ 0, 001 vs. CPZ + N3L.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Rezultatele prezentate în acest document demonstrează efectul benefic puternic al DHA și EPA asupra răspunsurilor microgliale la patologia mielinei. Capacitatea n-3 PUFA de a inhiba inflamația în timp ce crește fagocitoza în microglia stimulată cu mielină demonstrează noi posibilități interesante pentru tratamentul bolilor neurologice. În plus, constatarea unei schimbări M1-la-M2 indică o modulație favorabilă a fenotipului microgliei n-3 PUFA.

Efectele antiinflamatorii ale DHA și EPA au fost raportate într-o varietate de boli neurodegenerative, inclusiv accidentul vascular cerebral și boala Alzheimer 24, 25, 26, 27, 28, 29. S-a demonstrat că N-3 PUFA cresc fagocitoza microgliană a amiloidului β într-un model in vitro AD 30. Cu toate acestea, rolurile DHA și EPA în polarizarea microgliei și în patologia SM nu au fost cercetate anterior; acest studiu este primul care a studiat rolul PUFA n-3 în polarizarea microglială într-un model asociat cu boala demielinizantă. Am constatat că n-3 PUFA au efecte benefice asupra funcției microgliale prin inhibarea diferențiată a mielinei și a inflamației induse de IFN-γ și a creșterii fagocitozei mielinei. Aceste efecte funcționale au fost asociate cu polarizarea microglială către fenotipul M2 dominant. Polarizarea fenotipică poate promova un microambient care rezistă leziunilor inflamatorii și demielinizării ulterioare în SM, rezultând o funcție neurologică îmbunătățită in vivo .

Unele studii sugerează că o schimbare endogenă de la fenotipul microglial al M1 la M2 are loc la începutul remielinizării la modelele MS 6. În plus, epuizarea selectivă a celulelor fenotipice M1 sau M2 a arătat că promovează fenotipul M2, în timp ce fenotipul M1 afectează regenerarea oligodendrocitelor în acest model 6. Prin urmare, este posibil ca polarizarea M2 furnizată de n-3 PUFA să nu reducă doar demielinizarea, așa cum se arată în acest studiu, ci să beneficieze și de procesul de remielinizare în SM. Prin urmare, studiile în curs în laboratorul nostru investighează efectul PUFA n-3 asupra diferențierii oligodendrocitelor și remielinizării.

În plus față de efectele benefice asupra polarizării microgliale, studiul nostru recent a arătat și un efect protector direct al DHA împotriva excitotoxicității în oligodendrocite 31. Astfel, atât mecanismele directe (prin oligodendrocite), cât și cele indirecte (prin microglia) pot contribui la protecția substanței albe n-3 PUFA. Interesant este că doza optimă de DHA pentru efectul antiinflamator în microglia și efectul protector în oligodendrocite este de aproximativ 20 μM 31. DHA sau EPA într-o gamă similară de doze suprimă, de asemenea, inflamația în celulele T-helper umane și crește secreția factorilor antiinflamatori din monocite 32. În plus, un studiu efectuat pe animale a confirmat că suplimentele de DHA pot crește semnificativ nivelurile de DHA ale creierului la aproximativ 10-20 μM/g de țesut umed al creierului în câteva săptămâni 33. Datorită capacității lor de a viza mai multe tipuri de celule și ușurinței suplimentării alimentare, n-3 PUFA ar trebui investigate în continuare ca agent terapeutic pentru pacienții cu SM. Dacă DHA și EPA sunt capabili să provoace efecte de protecție similare la om, acești compuși naturali ar servi drept tratament sigur și ieftin pentru cei 2,3 milioane de oameni din întreaga lume care suferă de SM, precum și pentru nenumărați alți pacienți cu boli demielinizante.

metode

Culturi îmbogățite cu microglia primară

Culturile primare îmbogățite cu microglia au fost preparate din întregul creier al puilor de o zi, așa cum s-a descris mai sus 34. Pe scurt, țesuturile cerebrale au fost triturate după îndepărtarea meningelor și a vaselor de sânge. Celulele au fost apoi însămânțate într-un balon de cultură de 5 x 107 celule/150 cm 3 în mediu DMEM/F12 conținând 10% ser fetal bovin fetal inactivat, 2 mM L-glutamină, 1 mM piruvat de sodiu, 100 μM amino neesențial acizi. U/ml penicilină și 50 μg/ml streptomicină. După atingerea unui monostrat confluent de celule gliale (de obicei în decurs de 12 până la 14 zile de la inocularea inițială), microglia a fost recoltată, recoltată și rezecată. Culturile de microglia (97% puritate) au fost apoi tratate cu DHA sau EPA (Sigma, St. Louis, MO) dizolvate în mediu timp de 24 de ore, urmate de diferite concentrații de mielină și IFN-γ pentru încă 24 de ore.

Prepararea mielinei

Mielina a fost izolată din creierul șoarecilor în vârstă de 3 luni prin centrifugare cu un gradient de densitate zaharoză (0,32 M și 0,85 M) la 75.000 x g așa cum s-a descris mai sus 35. Conținutul de proteină mielină a fost determinat prin testul de proteină Bradford (Bio-Rad) cu albumina serică bovină ca standard. Concentrația de endotoxină a reziduurilor de mielină a fost