Posibilități de diagnostic de laborator a infecțiilor cauzate de Clostridium difficile

Abstract:

Clostridium difficile cu producerea de toxine este cea mai frecventă cauză a infecțiilor intestinale nosocomiale. Colita cu C. difficile este o boală infecțioasă de diferite grade de severitate, poate apărea ca o boală diareică obișnuită, colită pseudomembranoasă, dar și ca o afecțiune care pune viața în pericol, însoțită de ileus paralitic care progresează către sepsis secundar. Boala apare cel mai adesea în legătură cu tratamentul cu antibiotice cu spectru larg, care elimină flora intestinală normală. Transmiterea C. difficile are loc prin spori pe cale fecală-orală. Diagnosticul precoce al infecțiilor cu C. difficile este important datorită inițierii unei terapii adecvate, precum și a măsurilor anti-epidemice pentru a preveni răspândirea în continuare a sporilor în mediul spitalicesc.

posibilități

Cuvinte cheie: Infecții cu Clostridium difficile, colită pseudomembranoasă, diagnostic de laborator, glutamat dehidrogenază, tulpină toxigenă

* Toate tabelele, graficele și cifrele care fac parte din articol pot fi găsite în fișierul PDF atașat la sfârșitul studiului.

Introducere

Patogenia bolii

Epidemiologia bolii

Terapie

Procedurile de tratament pentru CDI sunt consacrate în recomandările slovace pentru diagnosticul și tratamentul colitei cauzate de C. difficile (7). Recomandările generale în tratamentul formelor ușoare de CDI sunt: ​​întreruperea tratamentului cu ATB care a cauzat infecția (dacă este posibil), rehidratare, dietă fără reziduuri. Dacă pacientul are niveluri scăzute de albumină, este necesară substituția parenterală. Medicamentele care suprimă peristaltismul intestinal (antispastice, opiacee) sunt contraindicate. Pentru tratamentul formelor moderate, severe și recurente de CDI, se recomandă tratamentul cu antibiotice medicamentoase: metronidazol, vancomicină și noul antibiotic macrociclic fidaxomicină. Probioticele sunt utilizate ca alte posibilități de tratament de susținere și în ultima perioadă și așa-numitele bacterioterapie fecală. Transplantul de scaun este o metodă oficial recomandată pentru tratamentul recurențelor multiple ale CDI cu o rată de succes ridicată, care depășește și regimurile de antibiotice existente (13).

Diagnostic de laborator CDI

Astăzi, sunt utilizate mai multe metode pentru diagnosticul microbiologic al CDI. Fiecare are un grad diferit de sensibilitate și specificitate, de aceea se recomandă o combinație. Examenul microbiologic țintit al scaunului este indicat la pacienții cu suspiciune clinică de CDI. Dimpotrivă, nu este indicat la pacienții cu scaune mulate și nu se face frecvent la copiii cu vârsta sub 1-2 ani.

Dovada antigenului C. difficile

Glutamatul dehidrogenază (GDH) este un antigen specific - o exoenzimă, produsă de toate tulpinile de C. difficile (toxigenă și netoxigenică). Dovada antigenului este posibilă direct din scaun, specificitatea testului este de 80 - 100%. Are o valoare predictivă negativă ridicată (VAN), t. j. un rezultat negativ exclude cel mai probabil posibilitatea infecției clostridiene. Cu toate acestea, testul nu face distincție între tulpini toxigenice și non-toxigene. Dezavantajul său este și posibilitatea reacției încrucișate cu alte specii de Clostridium spp. prezente în fecale (rezultat fals pozitiv în 20%). GDH poate fi determinat separat sau ca parte a testelor care detectează, de asemenea, toxine C. difficile.

Dovezi de toxine C. difficile (A/B)

Kituri de diagnostic bazate pe principiul testului imunosorbent legat de enzime sau imunocromatografie sunt utilizate pentru a detecta toxinele A/B. În prezent, există o serie de kituri comerciale disponibile pe piață cu sensibilități și specificități diferite. Avantajul lor este accesibilitatea, viteza, specificitatea ridicată, designul simplu, cu o interpretare clară a dovezilor de toxigenicitate a tulpinii. Testul are o valoare predictivă pozitivă ridicată (PPV), t. j. un rezultat pozitiv dovedește cel mai probabil o infecție clostridiană. Dezavantajul este sensibilitatea relativ scăzută (90%), ceea ce duce în unele cazuri la rezultate fals negative.

Cultivarea anaerobă

Cultivarea anaerobă a C. difficile este destul de solicitantă și lungă (2-3 zile). Pentru cultivare se folosesc soluri selective care conțin cefoxitină și cicloserină, care suprimă flora însoțitoare. Confirmarea descoperirii culturii este posibilă microscopic (orientativ), biochimic (prin anaeroteste comerciale), prin testul de aglutinare cu latex sau folosind tehnici mai noi (PCR - reacție în lanț a polimerazei, MALDI TOF MS - ionizare cu matrice asistată cu desorbție cu laser, timp de spectrometrie de masă de zbor). Testarea culturii este considerată necesară pentru toate probele de scaun în care s-a confirmat pozitivitatea GDH, inclusiv scaunele toxice negative. Testele imunochimice sau PCR pot fi utilizate pentru a detecta toxinele din cultura crescută. Avantajul examinării culturii este randamentul său ridicat, posibilitatea stocării culturilor izolate, determinarea sensibilității la antibiotice (ATB) sau tipare moleculară (scopuri epidemiologice).

Demonstrarea citotoxicității în culturile de țesuturi

Dovezile citotoxicității în culturile de țesuturi au o semnificație destul de istorică. Această metodă consumă mult timp, echipamente de laborator și experiență interpretativă, dezavantajul său este riscul de fals pozitivitate. Sensibilitatea este raportată ca 94-100%. Citotoxina poate fi detectată în fecale sau dintr-o tulpină difficile izolată pe culturile de țesuturi fibroblaste unde apare un efect citopatic.

PCR - dovezi ale genelor de toxicitate

Introducerea metodelor PCR, fie ca metode de screening sau de confirmare, în diagnosticul CDI este o tendință europeană. Acestea se caracterizează prin sensibilitate ridicată (99 - 100%) și specificitate, scurtând semnificativ timpul pentru a obține rezultatul. Valoarea PPV este redusă paradoxal, deoarece PCR este atât de sensibilă încât chiar și o cantitate mică de C. difficile toxigenic prezentă în colonizarea normală poate fi detectată în eșantion, nefiind astfel diferențiată colonizarea de infecție (14). Astăzi, avem seturi comerciale (bazate pe principiul PCR în timp real) pentru detectarea genei pentru producerea toxinei B, gena pentru toxina binară, seturi pentru detectarea delețiilor tipice unor ribotipuri PCR epidemice (de exemplu, 027, 176) . PCR este deosebit de importantă în verificarea formelor severe de CDI și în confirmarea rezultatelor vagi ale testelor anterioare.

Tastare C. difficile în scopuri epidemiologice

Metodele avansate de diagnosticare includ ribotiparea și toxinotipul, care se bazează pe PCR și analiza macro-restricției prin electroforeză cu gel pulsat (2). În timpul ribotipării C. difficile, regiunea dintre gene pentru ARNr 16S și 23S (așa-numita Regiune Distanțieră Intergenică) este amplificată. Există o diferență între ribotipurile individuale în numărul de alele ale acestor gene prezente și în lungimile secțiunilor dintre alele (6). Fiecare RT formează un profil electroforetic specific, conform căruia este identificat ulterior. Pentru a determina o RT specifică, electroforeogramele obținute sunt comparate cu baza de date web austriacă https://webribo.ages.at/. În total, au fost descoperite peste 800 de ribotipuri PCR și 24 de toxine.

Procedura de diagnostic recomandată

Material și metodologie

Abonament biologic material și transport la laborator Pentru examinarea microbiologică a fecalelor în vederea prezenței C. difficile, trebuie colectate minimum 2 ml de fecale într-un recipient steril. Scaunele trebuie procesate și examinate în decurs de două ore, deoarece toxinele sunt relativ instabile, se dezintegrează rapid și pot duce la falsă negativitate. Dacă nu este posibil să se examineze scaunul imediat după recoltare, se recomandă păstrarea probei la temperatura frigiderului (aproximativ 5 ° C), atunci stabilitatea toxinei este asigurată timp de 48 de ore. Pentru depozitarea pe termen lung a specimenelor, specimenul de scaun trebuie congelat la -70 ° C.

Rezultatele

Un total de 481 scaune de diaree din 3 spitale au fost examinate pe parcursul a 5 luni. O prezentare generală a departamentelor individuale din care provin probele investigate este prezentată în în tabelul 1. Din numărul total de scaune examinate, 104 probe GDH au fost pozitive (21,6%). După eliminarea cultivate fără succes, duplicat, resp. probele triplicate au rămas în setul de 66 de probe (66 de pacienți). Izolatele C. difficile din aceste scaune au fost supuse tipizării moleculare. Dintre cele 66 de probe, 58 (87,9%) au fost toxigenice (gene tcdA și tcdB prezente), din care 6 izolate au avut, de asemenea, gene ale toxinei binare (cdtA, cdtB). Restul de 8 probe din set (12,1%) au fost netoxice, i. j. nu au arătat prezența niciunei gene pentru producerea de toxine. Folosind un algoritm de diagnosticare în 3 pași și o combinație de alte metode (determinarea imunocromatografică a toxinelor și detectarea toxigenicității prin PCR), s-a constatat că din 58 de scaune toxice pozitive, 35 de probe aveau toxină pozitivă direct din scaun și 23 de probe ( toxină-negativă din scaun) la toxigenă cultura a confirmat pozitivitatea toxinelor (Masa 2).

Concluzie